High Throughput Crystal Observation and Confirmation of Rock Imager   

材料与试剂

1. 96-well 3-drop Swissci plates (SWISSCI，catalog number: 3W96TUVP)

仪器设备

1. 全自动晶体观察系统Rock Imager 1000 (Formulatrix，美国)

软件

1. Rock Maker软件

实验步骤

以使用Swissci的96孔坐滴板作为初筛的晶体板为例，其中每个晶体板的两个微孔用来筛选晶体。
一、启动Rock Maker软件
Rock Maker全面管理整个蛋白质结晶的过程，包括实验设计，管理自动成像时间表，图像浏览以及数据分析等。该软件与成像设备等紧密集成，形成一个完整的结晶自动化解决方案。双击电脑桌面的Rock Maker图标，即可打开软件。

二、为某一蛋白创建数据库

1. 展开Rock Maker软件中Explorer窗口中的Projects文件夹。右键点击，选择New Folder (如图1)，重新命名文件夹，如“protein screening”。
   
   
   图1. 为某一个新蛋白创建文件夹
   
   
2. 鼠标右键点击上述文件夹，选择New Project (如图2)，给project文件命名，如“Initial Screening”，并按回车键。
   注：命名中不可使用“/”，“*”，“%”或其他特殊符号。
   
   
   图2. 创建New Project
   
   
3. 鼠标右键点击新建的project文件，选择New Protein Formulation。给protein文件命名，如“1-ABC”，并按回车键。同样右键选择New Protein Formulation，给protein文件命名，如“2-XYZ”，并按回车键 (如图3)。
   
   
   图3. 创建新蛋白并命名
   

1. 鼠标右键点击新建的project文件，如“Initial Screening”，选择New experiment，给新建的experiment命名，如“Screening1”，并按回车键 (如图4)。有多个晶体板时使用同样的方法进行创建和编辑。
   
   
   图4. 创建experiment并命名
   
   
2. 在软件右边的Experiment Info中选择Plate Type为“3 Drop SWISSCI Plate” (如图5)。
   
   
   图5. 选择晶体板型
   
   
3. 点击Experiment Info窗口中下方Canvas按钮 (如图6中)。鼠标左键点击蛋白质“1-ABC”，按住鼠标并拖拽到右手边的96孔板微孔中 (即下图黄色标记的格子中)，松开鼠标，即可完成蛋白质的添加。重复上述操作，完成第二个蛋白“2-XYZ”的添加 (如图7)。
   注：确保两个蛋白质都加入至微孔板中，微孔的颜色变为浅绿/深绿色即成功添加。成像仪不会对空的微孔进行成像。
   
   
   图6. 将蛋白放置在晶体板对应的微孔位置
   
   
   图7. 两个蛋白添加至对应微孔位置
   

四、为某一晶体板设置自动观察成像程序
在Imaging Schedule窗口下方，可以选择不同的程序进行，此处选择Fibonacci数列。此处可以选择只用可见光进行拍摄，勾选Visible (Default)。设置成像仪内部温度为20 °C (如图8)。


图8. 设置仪器内部温度和拍照时间程序

五、打印晶体板条形码

1. 所有的编辑和设置完成后，点击软件左上角的保存按钮，保存所有信息。
2. 在编辑的Experiment处鼠标右键，选择Print Barcode (如图9)。
   
   
   图9. 选择打印条形码
   
   
3. 撕下编码条，粘贴到样品板没有切角的侧边 (切角为45 °)。有多个样品板时重复上述操作，如图10。
   
   
   图10. 粘贴条形码，在没有切角的一侧粘贴

六、装载样品板
逆时针转动黑色把手，拉开装载室的门。将一个或者多个样品板放入装载卡槽中，样品板粘贴条形码一侧靠仪器内，有切角一侧朝外放置 (如图11)。顺时针旋转把手锁门。


图11. 晶体板放置，条形码朝仪器里侧放置

七、样品板成像

1. 打开Rock Imager软件，在Load Port 中选择Scan Load Port (如图12)，样品板被识别。
   
   
   图12. 扫描样品板
   
   
2. 选择识别后的样品板，右键点击选择Move Plate to — Storage (如图13)，样品板被转移至存储位置，并开始按照设置的成像程序进行定时曝光成像。
   
   
   图13. 转移晶体板至Storage
   
   
3. 在Scheduling 中可以查看正在拍摄或者计划拍摄的样品板 (如图14)。在Imager中显示实时拍摄的微孔晶体图片 (如图15)。
   
   
   图14. Scheduling显示信息
   
   
   图15. Imager中显示实时拍摄信息

结果与分析

1. 晶体成像结果观察
   1.1

   在Rock Maker软件中可随时查看晶体成像结果 (如图16)，双击可以放大每个微孔进行观察 (如图17)。
   
   
   图16. 晶体板某一时间拍摄的晶体图片
   
   
   图17. 某一个drop拍摄的晶体图片
   
   
   1.2

   蛋白晶体与盐晶鉴定。在拍摄后的晶体图片观察中，使用可见光拍摄后，无法确定是否为蛋白晶体，可以使用仪器进行紫外光和偏正光的拍摄，进一步进行鉴定。选择晶体图片，右键点击选择Image Drop Using…，勾选UV (Default)和Cross Polarized，进行某一个微孔Drop 的紫外光和偏正光的拍摄 (如图18)。选择Image Plate Using…，可对整个晶体板进行紫外光与偏正光的拍摄。
   
   
   图18. 选择紫外光和偏正光拍摄晶体
   
   
2. 典型的蛋白晶体与盐晶判断
   紫外成像技术是利用色氨酸的紫外线荧光现象来区别蛋白晶体和其他晶体，并且有助于寻找在可见光下难以分辨的蛋白质晶体。
   偏光显微镜是利用光的偏振特性对具有双折射性的物质进行研究鉴定。双折射性是晶体的基本特征，因此可以使用偏光显微镜区分晶体与非结晶物质。
   结合Rock Imager拍摄的可见光、紫外光和偏正光的晶体图片，可以准确判断出蛋白晶体。为后续蛋白质晶体的优化和结构解析提供准确高效的方法，避免因使用其他方法进行蛋白质晶体确认而浪费时间。
   2.1

   以下列举几种使用Rock Imager拍摄的初筛的蛋白质晶体。下图通过可见光观察到晶体后，通过拍摄紫外光和偏正光，可以判断是蛋白质晶体 (如图19)。
   
   
   图19. 三个不同的蛋白初筛晶体图片
   
   
   2.2

   下图所示的晶体，在可见光下不易观察到，通过拍摄紫外光图片，可以帮助确定为蛋白质晶体。可以避免在晶体观察的观察中遗漏蛋白质晶体 (如图20)。
   
   
   图20. 两个不易观察的晶体，通过紫外光确认
   
   
   2.3

   下图是使用Rock Imager拍摄的在晶体初筛观察中出现的典型的盐晶。在可见光和偏正光下可以看到晶体，没有紫外吸收，是盐晶 (如图21)。
   
   
   图21. 盐晶在可见光、紫外光和偏正光下的显示
   
   
3. 晶体的生长情况检测
   Rock Imager按照设置的程序进行定时曝光拍摄。可以通过观察不同时间拍摄的晶体图片，监测晶体的生长情况，以此来判断用于收据收集的晶体的最佳生长时间，为收取高质量的晶体衍射数据提供基础。
   3.1

   下图是某蛋白晶体在生长的第4天和第12天拍摄的图片，可以明显看到随着时间越长，晶体在不断生长变大 (如图22)。
   
   
   图22. 某一蛋白第4天和第12天晶体生长图片
   
   
   3.2

   下图是某蛋白晶体在生长的第3天和第10天拍摄的图片，可以明显看到随着时间越长，晶体在不断生长变大的过程中，长成多晶的状态 (如图23)。
   
   
   图23. 某一蛋白第3天和第10天的晶体图片
   
   
   3.3

   下图是某蛋白晶体在生长的第8天、47天和第68天拍摄的图片，可以明显看到随着时间越长，晶体最终消失 (如图24)。
   
   
   图24. 某一蛋白第8天、47天和第68天的晶体图片
   

致谢

本文得到清华大学国家蛋白质研究技术中心的资助。

参考文献

1. 曾广策，朱云海，叶德隆．(2006). 晶体光学及光性矿物学 . 中国地质大学出版社. 武汉.