摘要:蛋白质在进行结晶的过程中要求蛋白质在溶液中的状态要稳定性良好,如果蛋白太容易聚集,或者太容易变性,都不利于蛋白晶体的形成,这也为蛋白结晶筛选提供了一条新的思路。本文介绍了如何通过蛋白质稳定分析仪Uncle来实现高通量蛋白质稳定性鉴定和buffer条件筛选。文中实验以溶菌酶溶液为例,Buffer条件以16种不同pH值为例,来进行实验操作和数据分析,高通量、全方面、多层次、快速地对蛋白缓冲条件进行筛选。
关键词: 蛋白质稳定性, 高通量测定, buffer条件筛选
材料与试剂
- 10 µl,200 µl移液枪头 (NEST, catalog number: 301006,302106)
- 1000 µl移液枪头 (QSP, catalog number: 112NXL-Q)
- 1.5 ml EP管 (ExCellBio, catalog number: CS015-0041)
- 50 ml 离心管 (Corning, catalog number: 430829)
- 密封条 (Unchained Labs, catalog number: 201-1013)
- UNi管 (Unchained Labs, catalog number: 201-1010)
- 溶菌酶 (Macklin, catalog number: L6051-25g)
- Stock Options pH筛选试剂盒 (Hampton Research, catalog number: HR2-241)
- 超纯水 (经过超纯水仪过滤后的去离子水)
- Stock Options pH筛选试剂盒中16种pH值缓冲液 (见溶液配方)
仪器设备
- 蛋白质稳定性检测仪 (生产商:美国Unchained Labs,model: UNcle)
- 4度高速离心机 (Thermo Scientific, model: Sorvall Legend Micro 17)
- 移液器 (Thermo Scientific, model: Finnpipette F1)
软件
- UNcle Client 5.03
- UNcle Analysis 5.03
实验步骤
一、样品溶液制备
- 溶菌酶溶液母液:
取溶菌酶样品40 mg,溶解到1 ml的超纯水中,轻微震荡5 min,用移液枪头轻轻吹打达到完全溶解后,放置到冰上1 h后,作为母液备用。 - Stock Options pH筛选试剂盒:
商业购买,开封后放置于4 °C恒温间储存,用于筛选实验。 - 16种不同pH条件的溶菌酶溶液制备:
从1中的溶菌酶母液中分别取16份50 µl母液到16个1.5 ml的EP管中,再将Stock Options pH筛选试剂盒中pH值为4.0, 4.2, 4.4, 4.6, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2的缓冲溶液分别取10 µl,加到之前的16个1.5 ml的EP管中,并分别再加入40 µl的超纯水混匀,将溶菌酶置换到16种缓冲溶液终浓度为5 mg/ml,最后使用4 °C高速离心机,12,000 × g转速离心2 min后,放置冰上,以备稳定性检测。
二、稳定性检测实验:
- 打开电脑和UNcle开关 (位于仪器背面右下角),待仪器与电脑USB连接成功 (四声叮咚之后),打开UNcle Client软件;选择“Operator”,输入密码“UNcle”登录;选择“Applications”,在下图1应用列表中选择需要的应用方法。
图1. 应用列表
- Tm&Tagg with DLS应用实验
- Isothermal Stability (等温稳定性实验)
结果与分析
- 蛋白初始状态 (25-27 °C) 粒度分布结果。
根据图5相关函数曲线可知16个缓冲液条件中分子粒径大小不一,大致可分为两组;由图6光强分布显示pH 7.0 – pH 8.2的众数粒径集中在 4 nm附近,约为溶菌酶单体粒径;pH 4.0 – pH 5.8众数粒径在200 nm附近,推测为溶菌酶聚集体。由图7质量分布峰可知pH 7.0 – pH 8.2的主要质量粒径分布集中在4 nm左右,pH 4.0 – pH 5.8主要质量粒径分布集中在200 nm左右粒径成分。因此,得出pH 4.0 – pH 5.8和pH 7.0 – pH 8.2条件是溶菌酶分别以两种不同聚集体形态存在于溶液中的条件。
图5. 相关函数曲线
图6. 光强分布峰
图7. 质量分布峰
- Tm&Tagg结果
如图8所示和表1所示,变性曲线 (BCM曲线) 叠加可通过转折点对应温度直观判断各个缓冲条件下结构热稳定性差异,在pH 5.0条件下变性曲线红移转折点最晚,即Tm最高,结构热稳定性最优;pH 4.0 – pH 7.0条件下Tm在73-76 °C之间,普遍高于pH 7.2 – pH 8.2组 (Tm在69-72 °C),因此偏酸的条件下更有利于蛋白保持高级结构。
图8. 变性曲线叠加
表1. Tm&Tagg平均值
Sample
| Tm Average
| Tagg Average
|
5 mg/ml pH 4.0
| 74.6
| 56.6
|
5 mg/ml pH 4.2
| 74.9
| 57.4
|
5 mg/ml pH 4.4
| 75.1
| 57.1
|
5 mg/ml pH 4.6
| 75.7
| 57.2
|
5 mg/ml pH 5.0
| 76
| 43.8
|
5 mg/ml pH 5.2
| 74.4
| 43.1
|
5 mg/ml pH 5.4
| 73.4
| 43.5
|
5 mg/ml pH 5.6
| 73
| 43.6
|
5 mg/ml pH 5.8
| 73
| 35.7
|
5 mg/ml pH 7.0
| 74.1
| 46.8
|
5 mg/ml pH 7.2
| 71.7
| 45.9
|
5 mg/ml pH 7.4
| 70.5
| 43.2
|
5 mg/ml pH 7.6
| 69.7
| 40.7
|
5 mg/ml pH 7.8
| 69.6
| 41.5
|
5 mg/ml pH 8.0
| 70.9
| 38
|
5 mg/ml pH 8.2
| 72.1
| 36.3
|
如图9所示,聚集曲线 (SLS266) 叠加通过横坐标峰值对应温度以及纵坐标散射光强度,发现蛋白在pH 4.0 – pH 4.6条件下聚集温度高,说明聚集较晚,且信号强度弱,说明聚集程度低,因此稳定性更好;pH 7.6 – pH 8.2条件下蛋白聚集温度低,说明聚集更早,且信号强,说明聚集程度高,因此胶体稳定性较差,容易形成不规则聚集。
图9. 聚集曲线 (SLS266) 叠加
- 等温稳定性结果
失败经验
- 为了保证实验结果的准确性,关于Tm&Tagg实验升温速率及plate hold time,推荐参数设置如下表2:
表2. 推荐参数设置
溶液配方
- Stock Options pH筛选试剂盒中16种pH值缓冲液配方如下表3所示:
表3. 16种pH值缓冲液配方
pH:
| Reagent:
| Titrant
|
pH 4.0
| 1.0 M Sodium acetate trihydrate
| Hydrochloric acid
|
pH 4.2
| 1.0 M Sodium acetate trihydrate
| Hydrochloric acid
|
pH 4.4
| 1.0 M Sodium acetate trihydrate
| Hydrochloric acid
|
pH 4.6
| 1.0 M Sodium acetate trihydrate
| Hydrochloric acid
|
pH 5.0
| 1.0 M Sodium citrate tribasic dihydrate
| Hydrochloric acid
|
pH 5.2
| 1.0 M Sodium citrate tribasic dihydrate
| Hydrochloric acid
|
pH 5.4
| 1.0 M Sodium citrate tribasic dihydrate
| Hydrochloric acid
|
pH 5.6
| 1.0 M Sodium citrate tribasic dihydrate
| Hydrochloric acid
|
pH 5.8
| 1.0 M Sodium citrate tribasic dihydrate
| Hydrochloric acid
|
pH 7.0
| 1.0 M HEPES sodium
| Hydrochloric acid
|
pH 7.2
| 1.0 M HEPES sodium
| Hydrochloric acid
|
pH 7.4
| 1.0 M HEPES sodium
| Hydrochloric acid
|
pH 7.6
| 1.0 M HEPES sodium
| Hydrochloric acid
|
pH 7.8
| 1.0 M HEPES sodium
| Hydrochloric acid
|
pH 8.0
| 1.0 M TRIS hydrochloride
| Sodium hydroxide
|
pH 8.2
| 1.0 M TRIS hydrochloride
| Sodium hydroxide
|
致谢
本文得到清华大学国家蛋白质研究技术中心的资助。本文得到美国Unchained Labs公司的仪器工程师马春花的帮助。
参考文献
- Unchained Labs. Uncle Instrument and Client Software User Guide.Revised 3/2017.
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Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王乐乐, 范仕龙. (2021). 高通量蛋白质稳定性鉴定和buffer条件筛选. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010877. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010877.
How to cite: Wang, L. L. and Fan, S. L. (2021). High Throughput Protein Stability Identification and Buffer Screening. // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010877. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010877.