¹⁹F NMR Based High Throughput Fragment Screening   

材料与试剂

1. 重水 (D₂O) 
2. 二甲亚砜 (DMSO) 
3. 超纯水 (H₂O) 
4. 甲酸 (FA) 
5. 乙腈 (ACN) 
6. 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 
7. 盐酸 (HCl) 
8. 氯化钠 (NaCl) 
9. 磷酸三氯乙酯 (TCEP) 
10. 缓冲液 (根据不同的研究对象需要不同的配方，如50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM TCEP) 
11. 液相色谱流动相 (0.1% FA in H₂O/ACN)
    

仪器设备

1. NMR波谱仪 (Bruker) 
2. Quadrupole LC/MS (Agilent) 
3. 离心机 (Thermo)
   

实验步骤

1. NMR配置和附件
   相比于¹H NMR的片段筛选方法，¹⁹F NMR筛选不仅能混合更多的配体化合物， 还能降低蛋白质和配体的浓度，从而提高了筛选和准确识别的效率，达到了节约时间和成本的双重目的。
   1.1

   磁场强度：建议使用500-700 MHz磁体。场强越高，灵敏度及通量越高。
   1.2

   探头：建议使用带¹H去耦功能的¹⁹F检测超低温探头，可实现最高的灵敏度。图1显示了不同¹⁹F功能基团经¹H去耦检测的信噪比 (S/N) 的提升。¹H 去耦对于CF₃基团检测而言影响不大，但它对CF/CF₂基团检测却是至关重要的 (至少能使信号强度增加10%)。布鲁克可提供多种¹⁹F{¹H} 探头，能大幅度增 强¹⁹F灵敏度。CryoProbe QCIF探头着重优化了¹⁹F灵敏度并带有¹H去耦功 能，因此该探头对于基于¹⁹F的筛选而言，无疑是最佳选择。该探头可完成每日高达100个混合物的样品测试，这意味着每日可筛选2000-3000个片段小 分子。
   
   
   图1. 不同¹⁹F功能基团经¹H去耦的信噪比的提升
   
   
   1.3

   自动进样器：建议使用低温型SampleJet，以实现通量提高和温度控制。SampleJet可存放5个96位样品架，处理多达480个NMR样品。其中每个样品架可单独设置温度 (4-44 °C之间)，以便同时分析水性缓冲液中的生物样品以及溶解在DMSO中的化合物。
   1.4

   液体处理器：建议使用SamplePro Tube。与手动操作相比，它能大幅度提高样品准备的效率。
   1.5

   核磁管：建议使用3 mm样品管，将所需样品量降到最低。
2. NMR筛选工作流程
   下图为筛选流程图 (图2)，主要包括片段分子质量检查、片段混合物制作、筛选以及分析过程，下文将进行逐步详细介绍。
   
   
   图2. NMR筛选工作流程图
   
   
3. 片段分子质量检查 (QC)
   全套质量检查需应用于所有候选分子 (即片段分子)，以用于剔除“低质量”的化合物 (如，错误的片段、错误的浓度、被污染或降解的化合物)。LC/MS可用于验证化合物的质量，并对所有杂质进行定量分析。一维¹H和¹⁹F NMR可用于测定化合物 的结构、纯度、浓度以及在水溶液中的溶解度，也可用于谱图质量分析。
   3.1

   常用LC/MS条件
   LC：C18色谱柱：3.0 mm × 50 mm, 1.8 µm；流动相A：水 (0.1% 甲酸)；流动相B：乙睛 (0.1% 甲酸)；梯度：3 min内相A从95%到5%；流速：0.3 ml/min；温度：25 °C；进样量：5 µl；紫外检测：210 nm。
   MS：离子源：API-ES；模式：Scan；极性：Positive；干燥气流速：10 L/min；雾化器压力：35 psi；干燥气温度：350 °C；毛细管电压：4000 V。
   3.2

   常用1D NMR参数
   ¹H：布鲁克标准实验 CMC_SINGLE_H2O；PULPROG zgesgp，TD 16 k， SW 15 ppm，O1p 4.7 ppm，NS 32。
   ¹⁹F：布鲁克标准实验 SCREEN_19F_T2；PULPROG cpmgigsp，TD (F2) 128 k，TD (F1) 2，SW 200 ppm，O1p -140 ppm，D21 40 ms，VCLIST cpmg_screen_19F (0, 5)，NS 128。
   3.3

   NMR自动采样与分析
   QC可通过对缓冲液中片段分子¹H/¹⁹F谱图自动采集来实现。图3举例说明了在IconNMR中进行自动的¹H谱数据采集过程随后软件可自动分析1H信号，并与预定义的结构 (分子文件)相比对，以达到结构验证的目的。
   
   
   图3. IconNMR可加载MS Excel或CSV格式的用户自定义文件自动采集数据 (菜单文件/导入电子表格)
   
   使用Mnova Gears，可批量处理片段库质量检查工作 (Verify + Concentration + SQA)。下图可见MGears (https://mestrelab.com/) 的工作流程示例。
   
   
   图4. 数据采集后可利用所需模块展开即时分析 SQA：谱图质量评估；Verify： 结构验证；Concentration：浓度测定
   
   如下截图所示，分析结果可以表格形式显示。并且在Mnova NMR中，简便地展开每个片段的细节。
   
   
   图5.上图为片段的总视图：气泡的颜色和大小代表了结构验证的结果（绿色表示通过，红色表示不通过)。下图展示了某个片段的详细信息：包括¹H谱、分子中 ¹H信号的指认、浓度(mol/l) 和纯度 (%)。
   
   
4. 片段混合物的制作
   片段库可通过市场上可购买的或实验室自有的含¹⁹F片段分子来构建。片段库设计需在化学空间上达到最大覆盖率并遵循RO3原则 (Congreve et al., 2003)。
   为了提高NMR筛选方法的通量，通常将多个片段混合同时进行测定。而在¹⁹F 筛选实验中，混合物可包含15到30个片段。在设计过程中，需多加注意，避免混合物¹⁹F谱中出现片段谱峰重叠现象。一旦完成混合物设计，便可将其应用于所有的筛选实验。
   CF₃和CF/CF₂基团的氟原子数和弛豫特性有所不同，因此针对两类基团需分别进行片段分子混合，并使用不同的实验参数 (化合物浓度、氟谱谱宽、弛豫滤波的时间等) 进行筛选。
   Mnova MixDesign软件 (图6) 可自动完成片段混合物的设计。根据设计结果制备混合物，并将混合物溶于DMSO中，储存于-20 °C备用。
   
   
   图6. 片段混合物设计的堆叠视图
   
   
5. 筛选样品的制备
   5.1

   靶标蛋白：使用前进行表达、纯化和浓度分析。样品需分装并储存在-80 °C下合适的缓冲液中 (如75 μM)。每次实验拿取单次用量即可，并在冰中解冻。 不要重复冻融靶标蛋白。
   5.2

   片段混合物原液：CF₃ 和CF/CF₂ 混合液需储存在-20 °C下DMSO中 (如1.5 mM)。使用前解冻到室温。
   5.3

   筛选样品：

   1)

   建议先准备一个样品，然后将其一分为二。这样可以确保两个样品中化合物含量完全相同。

   2)

   CF₃混合物：通常最终浓度为20 µM (体积180 µl)。

   3)

   CF/CF₂混合物：通常最终浓度为40 µM (体积180 µl)。

   4)

   靶标蛋白：通常最终浓度为2 µM (体积180 µl)。

   5)

   配制过程示例：D₂O 36 µl (10%)，缓冲液319.2或314.4 µl，以及1.5 mM浓度的CF₃ 4.8 µl或CF/CF₂ 9.6 µl，离心混合后分成两个样品 (每个 180 µl)。在其中一个样品中加入5 µl 75 µM浓度的蛋白。在4 °C下离心 孵育15 min，然后转移到3 mm样品管中。
6. NMR实验/筛选
   ¹⁹F谱检测是通过Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) 实验来实现的，需分别检测不含蛋白质的样品 (即空白样品) 和含有蛋白质的样品，随后评估两个样品之间谱峰强度的变化。相比CPMG_blank，如果某个谱峰的强度在CPMG_protein实验中降低了，并下降幅度超过了一个预定义的阈值，那么该化合物被标记为命中。反之，没有变化或谱峰强度变化很小，那么这表明该化合物没有与靶标相结合，因此不被标记为命中。所以说，通过比较筛选样品和参考谱图，可以揭示该化合物是否与靶标蛋白有结合 (图7)。
   
   
   图7. 模拟¹⁹F 信号: P1 和P3在含有蛋白质的样品中降低了, 而P2保持不变，说明1号和2号化合物为命中化合物
   
   TopSpin配置了标准的CPMG NMR实验 (如SCREEN_19F_T2)，且该实验 设计的初衷便是让实验简单易用且能自动化运行。该实验是一个测定¹⁹F的假二维实验，通过预设的VCLIST，设置两个自旋回波的循环次数进行不同长度的T2滤波，默认值为0 (无CPMG滤波) 和5 (有CPMG滤波)。如前所述，由于CF₃和 CF/CF₂基团具有不同的弛豫特性，因此建议对其采用不同的实验设置。
   实验步骤：
   6.1

   将准备好的样品放置到SampleJet自动进样器中。
   6.2

   在IconNMR中载入IconNMR设置文件，并点击启动键 (图8)。在IconNMR 设置中检查是否有合适的、可以使用的NMR预设实验。常用参数：PULPROG cpmgigsp，TD (F2) 128 k，TD (F1) 2，D21 40 ms，NS 128；CF3：SW 100 ppm，O1p -90 ppm，VCLIST cpmg_screen_19F (0, 6)；CF/CF2：SW 200 ppm，O1p -140 ppm，VCLIST cpmg_screen_19F (0, 3)。
   或者还可以选择使用经优化的一些宽带去耦脉冲 (如BURBOP)，以优化大范围化学位移的波谱去耦 (Lingel et al., 2020)。
   
   
   图8. 在IconNMR中自动运行标准筛选实验
   
   
7. 筛选结果分析
   如下截图所示 (图9)，布鲁克TopSpin内置的片段筛选工具 (FBS) 可对数据进行手动分析以及查看。
   
   
   图9. FBS中筛选数据谱图
   
   筛选窗口内提供了一些链接，能可视化片段混合物概况以及查看单个片段信号 (图10)。
   
   
   图10. FBS中筛选数据的概况
   
   FBS可将数据规整起来，从而Mnova Screen软件可直接进行后续的自动命 中分析 (Peng et al., 2016)。
   布鲁克与牛津大学的Y. Dubianok最近展开了合作，对NUDIX水解酶 (NUDT5 二聚体)进行了¹⁹F NMR筛选 (Dubianok et al., 2019)。实验使用的含氟片段库购于英国康沃尔Key Organics有限公司。该研究使用了布鲁克700 MHz磁体， AVANCE NEO谱仪，并配备了QCIF Helium CryoProbe探头进行筛选， 采用了¹⁹F{¹H} CPMG实验方法。从片段筛选中，研究人员得到了若干命中化合物， 并从中挑选了16个， 用于进一步的X射线衍射表征。其中50% 的化合物成功 得到了X射线蛋白质/片段晶体结构，并被录入PDB (蛋白质数据库)，这说明了 NMR筛选技术的高效率产出。图11和12展示了其中一个命中化合物的例子 (片段1R-0641)。结果编辑器 (图11)中可显示所有样品 (实验栏)中所有配体 (片段列) 的状态。下拉菜单可显示其他结果，如谱峰积分的平均/最大变化，匹配峰的百分比，以及每个配体的名称。双击实验选项可显示相应的波谱文件，其中包含单个和堆叠视图，以便进行可视化分析验证。
   
   
   图11. 筛选分析结果概况 颜色编码: 蓝色代表命中，橙色代表存在，红色代表缺失。片段1R-0641为蓝色命中。
   
   
   图12. Mnova Screen可自动进行¹⁹F筛选分析
   
   基于配体检测NMR筛选的优势之一，是对靶标的尺寸没有大小限制。Binas et al. (2021)提供了一个真实存在的案例。文中，研究人员对具有不同二级和三级结构的14个RNA靶标进行了¹⁹F NMR筛选，以系统地评估RNA的可成药性。通过对 RNA靶标进行片段筛选，命中率高达26%。而这些针对RNA的应用目前显得尤为重要，因为这项研究将有助于识别具有抗病毒活性的新配体，以用于对抗新冠肺炎病毒大流行。
   
   后续验证:
   由于受到交换展宽等效应的影响，筛选实验中得到的信号变化结果 (即结合时增加的弛豫速率) 与配体的亲和力大小无正比关系。通常情况下，筛选后需要进一 步对命中化合物进行排位和确认。现有常用技术包括竞争NMR法、基于靶标的2D NMR法、优化的¹⁹F NMR实验 (CSAR，基于化学位移各向异性的亲和力排位) 或X射线衍射等。这方面的内容在此不作详细讨论。
   

注意事项

如需在实验室中开展基于片段的筛选工作，建议先利用已知结合模型的样品进行测试，以确保整个实验流程能顺利运行。利用这些样品优化参数，获得最佳的结果，这对后续定制化筛选实验也大有帮助。

致谢

文中部分数据来自于之前在诺华的工作，感谢Andreas Lingel的支持。我们还特别感 谢Donna Baldisseri、Ian Clegg和Anna Codina对全文的审校工作

参考文献

1. Bruker Fragment-based Screening. Brochure. https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr-pharma-solutions/lead -discovery-and-optimization.html
2. Mnova and MGears software. https://mestrelab.com/
3. Congreve, M., Carr, R., Murray, C. and Jhoti, H. (2003). A 'rule of three' for fragment-based lead discovery? Drug Discov Today 8(19): 876-877.
4. Lingel, A., Vulpetti, A., Reinsperger, T., Proudfoot, A., Denay, R., Frommlet, A., Henry, C., Hommel, U., Gossert, A. D., Luy, B. and Frank, A. O. (2020). Comprehensive and high-throughput exploration of chemical space using broadband ¹⁹F NMR-based screening. Angew Chem Int Ed Engl 59(35): 14809-14817.
5. Peng, C., Frommlet, A., Perez, M., Cobas, C., Blechschmidt, A., Dominguez, S. and Lingel, A. (2016). Fast and efficient fragment-based lead generation by fully automated processing and analysis of ligand-observed NMR binding data. J Med Chem 59(7): 3303-3310.
6. Dubianok, Y., Krojer, T., Kovacs, H., Moriaud, F., Wright, N., Strain-Damerell, C., Burgess-Brow, N., Bountra, C., Arrowsmith, C. H., Edwards, A., von Delft, F.. (To be published). (2019). PanDDA analysis group deposition - Crystal Structure of NUDT5 in complex with 1R-0641.
7. Binas, O., Jesus, V. D., Landgraf, T., Völklein, A. E., Martins, J., Hymon, D., Bains, J. K., Berg, H., Biedenbänder, T., Fürtig, B., Gande, S. L., Niesteruk, A., Oxenfarth, A., Qureshi, N. S., Schamber, T., Schnieders, R., Tröster, A., Wacker, A., Wirmer-Bartoschek, J., Martin, M. A. W., Stirnal, E., Azzaoui, K., Richter, C., Sreeramulu, S., Blommers, M. J. J. and Schwalbe, H. (2021). ^{19F NMR-based fragment screening for 14 different biologically active RNAs and 10 DNA and protein counter-screens.} ChemBioChem 22(2): 423-433.