摘要:酶是生命活动的重要调控者,引起多种生物活性分子的修饰,通过蛋白磷酸化、乙酰化、泛素化等修饰参与调控多种细胞信号转导,包括细胞增殖、凋亡和代谢等。因此,在药物开发领域,酶是重要的靶点蛋白,如激酶、吲哚胺双加氧酶、泛素化酶、乙酰转移酶、溶菌酶、肌醇酶、DNA糖基化酶等。酶活抑制剂的筛选常利用含染料的底物或能够生成荧光物质的探针,经酶催化反应后生成具有荧光的物质 (如蛋白酶介导的肽荧光基团的裂解),或酶促反应生成的产物/副产物与对其敏感的探针发生反应,生成具有荧光的副产物,然后利用荧光检测方法获取相关信号。本文介绍了高通量筛选乙酰转移酶小分子抑制剂的实验方法。筛选分为初筛和二次筛选两部分。初筛利用生化水平酶活反应系统,针对一万多种小分子化合物展开,经重复验证,初筛阳性率约1%。进而,利用基于SPR技术的Biacore 8K仪器开展二次筛选。经过两轮筛选,最终获得约3‰能够结合酶蛋白且有效抑制酶活的苗头化合物。该筛选方法简便快捷,筛选结果稳定可靠,为靶向乙酰转移酶的药物研发提供候选分子,同时有希望应用于其它种类的酶活抑制剂的筛选工作。
关键词: 高通量, 化合物筛选, 酶活抑制剂
图文摘要
乙酰转移酶活性抑制剂的筛选实验总流程图。使用Multidrop和Bravo等自动化仪器将化合物稀释和分装到实验用384孔板内进行生化反应,随后利用Envision仪器测定实验信号,挑选出初筛阳性化合物。进一步应用Biacore 8K仪器开展二次筛选,并测定靶蛋白与化合物的亲和力。
材料与试剂
- 96孔板 (Costar, 3879)
- 96孔板 (Greiner, 650101)
- 384孔板 (PE, OptiPlate, 6007279)
- TCA (Sigma, T6399-100G)
- CPM (Sigma, C1484-25MG)
- Tris-HCl (Sigma, 10812846001)
- NaCl (Sigma, S9888-1KG)
- Glycerol (国药集团化学试剂有限公司, 10010618)
- TWEEN-20 (Beyotime, ST825)
- Sensor Chip CM7传感器芯片 (GE Healthcare, 29147020/29-1470-20)
- EDC (GE Healthcare, Amine Coupling Kit, BR-1000-50)
- NHS (GE Healthcare, Amine Coupling Kit, BR-1000-50)
- 乙醇胺 (GE Healthcare, Amine Coupling Kit, BR-1000-50)
- 醋酸钠 (GE Healthcare, Acetate 5.5, BR-1003-52)
- HBS (GE Healthcare, HBS-N buffer, 10x, BR-1006-70)
- DMSO (Sigma, D2650-100 ml)
- 化合物 (由中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台提供)
仪器设备
- Multidrop自动分液器 (Thermofisher, model: Multidrop Combi)
- Bravo自动化液体处理平台 (Agilent, model: Bravo)
- Envision多标记微孔板检测仪 (PE, model: Envision)
- 离心机 (Eppendorf, model: 5810R)
- Biacore 8K (GE Healthcare, model: Biacore 8K)
实验步骤
一、生化水平酶活筛选系统
- 化合物的准备
绝大部分化合物溶解在100% DMSO中,储存浓度为10 mM,以96孔板 (Costar, 3879) 模式保存在-80 °C冰箱。室温平铺解冻,注意避光。解冻后离心129 × g,2 min。用Multidrop仪器向化合物板中加入缓冲液I,使化合物浓度稀释100倍至100 μM,震荡混匀后离心129 × g,2 min。384孔板反应体系中化合物的终浓度为10 μM,所以总共需要稀释1000倍,分两步完成。 - 酶活反应系统
二、酶蛋白与化合物亲和力测定
Biacore 8K的检测原理基于表面等离子共振 (SPR) 技术,可以用于研究分子之间的相互作用。该技术基本操作流程为:将一种互作分子固定在芯片表面作为配体,另一种互作分子作为分析物以流动相的形式流过芯片表面。仪器传感器对距离芯片表面约150 nm内光的折射率变化非常敏感,当物质结合在芯片表面时,入射光的折射将根据物质结合的量产生相应的折射率变化,仪器可将光的折射变化转换成结合信号 (即RU值)。芯片上结合的物质越多,其RU值越大。
测定酶蛋白与化合物亲和力,首先需要把配体 (酶蛋白) 通过氨基偶联的方式固定在CM7芯片上,然后将一定浓度的化合物流经芯片表面,观察传感器捕捉的结合信号,通过与DMSO对照组的响应值进行比较,区分出与酶蛋白分子有结合的小分子化合物。本实验分为单浓度筛选和多浓度测定亲和力两个步骤。
- 单浓度筛选可与酶蛋白结合的化合物
- 酶蛋白与化合物的亲和力测定
经过单浓度筛选,确定了与酶蛋白有结合的小分子化合物。接下来进行化合物与酶蛋白亲和力测定。在本次实验中,我们对化合物进行了系列浓度梯度稀释。根据预实验确定化合物最高浓度为100 μM,后续浓度以2倍比例进行梯度稀释,最终每种化合物设置10个浓度点。实验中所有化合物运行遵循从低浓度到高浓度的进样顺序。本次实验无再生过程。
实验注意要点
- 本次实验中,为保证酶蛋白的活性,酶蛋白溶液的配制以及与小分子化合物的孵育过程都在低温条件下操作。
- 实验系统中若有荧光试剂,应采取避光措施。例如,筛选所用多孔板的板盖在实验前用锡箔纸包裹。
- 有一些试剂直接用缓冲液稀释可能会出现不溶解的现象,例如CPM,可以先用原溶剂DMSO进行2-10倍稀释后,再用缓冲液进行稀释。
- 生化水平荧光信号的检测,优先选择全黑板进行实验。
- 某些情况下,可向生化水平筛选所用缓冲液中添加适当的去除非特异性结合的试剂,有利于提高信噪比。例如BSA,Tween20等。
- 缓冲液最好现配现用,实验前用0.22 μm滤膜过滤。
- 化合物一般以10 mM储存在100% DMSO中,从DMSO相到水相的稀释比例不低于1:100,以保证化合物的充分溶解。
- 本次实验目的是要筛选可以和靶蛋白结合的小分子化合物,该类实验宜将靶蛋白作为配体,将待筛选的小分子化合物作为分析物。这种情况下,所需的配体偶联量通常较高,应优先选择氨基偶联的方式来固定配体。如果所需偶联量小于20,000 RU,通常选择CM5芯片;当所需偶联量大于20,000 RU时,应选择CM7芯片。经计算,本实验所需偶联量大于20,000 RU,故选择CM7芯片。
溶液配方
- 缓冲液I:20 mM Tris-HCl,pH 8.0,150 mM NaCl,5% glycerol。现配现用,0.22 μm滤膜过滤。
- 缓冲液II:HBS + 1% DMSO。现配现用,0.22 μm滤膜过滤。
致谢
该研究得到国家自然科学基金重大研究计划重点项目 (基金号:91853204) 的资助,感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台的大力支持。
参考文献
- Dahlin, J. L., Sinville, R., Solberg, J., Zhou, H., Han, J., Francis, S., Strasser, J. M., John, K., Hook, D. J., Walters, M. A., Zhang, Z. A. (2013).Cell-Free Fluorometric High-Throughput Screen for Inhibitors of Rtt109-Catalyzed Histone Acetylation. PLoS ONE 8(11): e78877.
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Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:杨文思, 陈晓慧, 张林, 兰姝珏. (2021). 高通量筛选乙酰转移酶活性抑制剂. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010873. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010873.
How to cite: Yang, W. S., Chen, X. H., Zhang, L. and Lan, S. Y. (2021). High-throughput Screening of Acetyltransferase Inhibitors. // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010873. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010873.