A brief version of this protocol appeared in:
Advertisement

Navigate this Article


 

High-Throughput Screening of Small-molecular Targeting Biomolecular by Biacore8K+   

常卿常卿*杨姊杨姊*李文奇李文奇  (*contributed equally to this work)
How to cite Favorites Q&A Share your feedback Cited by

摘要:目前创新药物开发的源头是发现具有生物活性的先导化合物,对各种化合物库的高通量筛选是最重要的组成部分。Biacore8K+是基于表面等离子共振 (Surface plasmon resonance,SPR) 技术的高通量分子水平的相互作用分析系统。具有高通量,无标记,自动化,高灵敏度等特点。通过将表达纯化的目标蛋白分子通过氨基偶联的方法固定在生物传感芯片上,将待测的分析物以一定浓度流过芯片表面,若二者之间有相互作用,则芯片表面的折射率发生变化从而导致共振角的改变。通过实时检测共振角的变化,可全面提供分子间相互作用的动力学和亲和力信息。

关键词: 表面等离子共振, 高通量筛选, Biacore 8K+

材料与试剂

  1. LB培养基 (BD, catalog number: 214906)
  2. 咪唑 (北京拜尔迪生物技术有限公司, catalog number: DE0279)
  3. NaCl (北京拜尔迪生物技术有限公司, catalog number: DE0008)
  4. Tris (北京拜尔迪生物技术有限公司, catalog number: DE0006)
  5. PTG (异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) (生工生物工程 (上海) 股份有限公司,catalog number: A100487)
  6. 重组表达人冠状病毒蛋白NSP5的大肠杆菌 (来自北京协和医院张抒扬课题组)
  7. Superdex200 increase 10/300 GL (Cytiva, catalog number: 28990944)
  8. 预染蛋白Marker (Thermo Scientific, PageRuler, catalog number: 26616)
  9. 氨苄青霉素Amp (北京拜尔迪生物技术有限公司,catalog number: DE0086)
  10. 镍亲和柱 (Cytiva, Ni Sepharose 6 FF, catalog number: 11000887)
  11. 浓缩管 (Merck, catalog number: UFC8010)
  12. S系列CM5芯片( Cytiva, Series S Sensor Chip CM5, catalog number: 29149603)
  13. 无盖EP管 (Cytiva, catalog number: BR100287)
  14. 96孔板 (Cytiva, catalog number: BR100503)
  15. 封口膜 (Cytiva, catalog number: 28975816)
  16. 醋酸钠缓冲液 (Cytiva, Acetate 4.0, catalog number: BR100349; Acetate 4.5, catalog number: BR100350; Acetate 5.0, catalog number: BR100351;Acetate 5.5, catalog number: BR100352)
  17. 氨基偶联试剂盒 (Cytiva, catalog number: BR100050)
  18. DMSO (Sigma-Aldrich, catalog number: 34943)
  19. 10x PBS-P (Cytiva, catalog number: 28995084)
  20. 抗COVID-19中药单体库 (TargetMoI, catalog number: L6720)
  21. LB液体培养基 (见溶液配方)
  22. TBS缓冲液 (见溶液配方)
  23. 1 M咪唑 (见溶液配方)
  24. Buffer1 (见溶液配方)
  25. Buffer2 (见溶液配方)
  26. Buffer3 (见溶液配方)
  27. Buffer4 (见溶液配方)
  28. 1.05x PBS-P (见溶液配方)
  29. 含有不同浓度DMSO溶液(见溶液配方)

仪器设备

  1. 实验室水纯化系统 (PALL, model: S41142CE)
  2. 胶片观察灯 (北京六一生物科技有限公司,model:WD9405)
  3. 摇床 (Thermo Scientific, model:SHKE8000)
  4. 紫外可见分光光度计 (Biochrom WPA, model:Biowave II, catalog number: 80300375)
  5. 制冰机 (雪科电器有限公司,model: CK2021010042)
  6. 大容量离心机 (Beckman Coulter, model:Avanti J6-MI)
  7. 高速冷冻离心机 (Beckman Coulter, model:Avanti J-26S XP)
  8. 超声破碎仪 (Sonica, model:q700)
  9. AKTA蛋白纯化系统 (GE Healthcare, model:Pure10)
  10. 蛋白电泳仪 (Bio-Rad, model: L00657)
  11. 蛋白胶染脱色仪 (金斯瑞生物科技有限公司,model: L00760C)
  12. 蛋白定量仪 (Unchained Labs, model: Little Lunatic)
  13. Biacore8K+相互作用分析系统 (Cytiva, Biacore8K+system,model: 29283382)
  14. 离心机 (Eppendorf, model: 2231000771)
  15. 真空脱气装置 (Millipore, model: WP6122050)

软件

  1. 系统控制软件:BiacoreTM8K Control Software
  2. 数据分析软件:Biacore Insight Evaluation

实验步骤

一、实验准备

  1. 目的蛋白NSP5的制备
    1.1
    重组蛋白表达
    1)
    挑取重组大肠杆菌平板单菌落,接种于20 ml含有氨苄抗性(100 μg/ml)的LB液体培养基中,160 r/min,37 °C摇床培养过夜,约16小时。
    2)
    将过夜培养的菌液,按1:100接种于1 L含有氨苄抗性 (100 μg/ml) 的LB液体培养基中,37 °C,220 r/min培养至OD600达到0.4~0.6,降温至16 °C,加入终浓度1 mM IPTG诱导培养20小时。
    3)
    收菌:取出摇瓶置于冰上使菌液降温,倒入离心桶配平,用大容量离心机4000 x g,4 °C离心20分钟,倒掉上清液,收集菌体。
    4)
    用Buffer1 (见溶液配方) 重悬菌体,将重悬液冰浴进行超声破碎 (时间10 分钟,超声3秒,间隔5秒,功率45%)。
    5)
    将裂解液,14000 x g,4 °C高速离心1小时,取上清即为粗提蛋白液。
    1.2
    重组蛋白纯化
    1)
    镍亲和纯化:Buffer1平衡镍亲和柱至少5个柱体积;将粗提蛋白液上样;Buffer1清洗柱子至少20个柱体积;Buffer2 (见溶液配方) 清洗柱子至少20个柱体积;Buffer3 (见溶液配方) 洗脱样品,从第2个柱体积开始收集,收集5个柱体积洗脱液。
    2)
    分子筛纯化:将镍亲和纯化洗脱液上样到预先使用Buffer4 (见溶液配方) 平衡过的分子筛层析柱Superdex200 increase 10/300 GL,收集目的蛋白。
    3)
    SDS-PAGE分析每一步的样品,确定目的蛋白的表达量和纯度。
  2. Biacore8K+仪器准备
    2.1
    打开控制软件,设置温度,包括芯片室温度和样品室温度(两者温度范围4-40 °C可调)
    2.2
    系统管路润洗,将经过脱气过滤处理的超纯水和流动相缓冲液放置在仪器右侧相应管位。检查废液收集器是否已清空。
    2.3
    芯片放置,在操作界面点击Change chip,按操作说明取出维护芯片,放入新的实验芯片 (如图1所示),填写芯片相关信息,点击Dock chip。


    图1. S系列CM5芯片

  3. 目的蛋白的偶联
    3.1
    目的蛋白偶联量计算

            Rmax 为芯片表面最大结合容量,在小分子测试中通常代入100 RU。analyte MW 和 ligand MW 分别为小分子和目标蛋白的分子量,Sm 为化学计量比,未知时选择1。RL 为目标蛋白偶联水平。实验时实际偶联量为1.5 x RL。由于小分子分子量的限制,通常选择 Contact time 模式进样实现高偶联,以提高检测的灵敏度。
    3.2
    偶联最适pH条件摸索
            将目的蛋白用pH 4.0/pH 4.5/pH 5.0/pH 5.5的10 mM醋酸钠缓冲液分别进行稀释,到终浓度20 μg/ml,根据pH Scouting程序中的设置要求加样到96孔板中。执行程序后得到如图2所示结果。选择预富集效果较好同时保证目的蛋白活性状态的pH作为后续进行氨基偶联的条件。具体详见“失败经验”第一条。


    图2. pH Scouting结果图

    3.3
    目的蛋白的偶联
            根据pH Scouting的结果,选择pH 5.0条件,将目的蛋白稀释到相应pH的醋酸钠缓冲液中,终浓度20 μg/ml。在96孔板对应位置加入NHS, EDC和乙醇胺溶液,其中NHS/EDC起到活化芯片表面基团的作用,乙醇胺起到封闭未反应的芯片表面基团的作用。执行完偶联程序后得到如图3所示结果。


    图3. CM5芯片8个通道进行目的蛋白氨基偶联的结果图 (标记过程分为活化,偶联和封闭三个步骤,最终偶联量为两条蓝色虚线对应的差值,本次实验偶联量大概在12000 RU)

  4. 溶剂校正
            本实验采用四点校正法,相应的标准液的配制方法见 (溶液配方9)。四点校正标准液的响应值相对于5% DMSO流动相缓冲液的基线应当落在-500 RU到1000 RU之间。本次实验校正曲线如图4所示,蓝色竖线对应的响应值落于校正区间内即符合要求。


    图4. 溶剂校正结果示意图

  5. 待筛选化合物库的配制
    5.1
    用1.05x PBS-P 缓冲液稀释10 mM小分子母液 (100% DMSO) 20倍,得到500 μM小分子 (5% DMSO)。
    5.2
    用5% DMSO流动相缓冲液将分析物浓度稀释到50 μM 作为最高进样浓度。

二、利用Biacore8K+高通量互作分析系统进行高通量筛选

  1. 方法设置
    1.1
    在控制软件界面点击Methods,选择数据库中的方法LMW screen 1,进入Method Builder界面,在Method Definition界面,填写相关信息,设置结合/解离时间均为60 sec, 流速30 μl/min,填写浓度为50 μM,见图5。


    图5. 控制软件中方法设置Method Definition 界面示意图

    1.2
    点击Variables and positioning。在Startup界面,添加3个cycle。在Samples and controls界面输入样品名称和分子量,设置孔板类型和定义样品位置。
    1.3
    点击Cycle overview检查整个实验流程设置 (图6),可以随时退回Method Definition界面进行调整设置。


    图6. Cycle overview界面对整个实验流程的描述

  2. 加样
    2.1
    打印Plate layout信息 (图7),并按照该信息进行样品板的加样。


    图7. Plate layout界面示意图

    2.2
    注意加样过程尽量避免气泡。可将孔板进行离心排除气泡。
    2.3
    为防止实验过程中样品挥发,可以加盖配套的封口膜。
    2.4
    再次确认Buffer bottle,Water bottle,Reagent bottle都已加好足够本次实验的缓冲液,分别为5% DMSO流动相缓冲液,去离子水,50% DMSO缓冲液 (见图7左上方Bottles项提示,配制方法见溶液配方)。
  3. 放置样品板到样品架上,注意每个样品架可以放置左右两块样品板,每块孔板A1孔位对应在样品架左下角的位置 (图8),放置好后,扳动锁定装置固定每块样品板。之后按照程序设定的次序将样品架放置到样品仓对应的层位。关好样品仓门。


    图8. 放置好左右两块样品板的样品架示意图

  4. 再次确认各项无误后,将编辑好的方法通过点击Send to queue,发送到待执行程序序列中,点击Ready to start,选择该实验的保存路径点击Save,即开始进行数据收集。
    注:当芯片室未达到设定温度时,实验不会开始
  5. 数据分析采用Biacore Insight Evaluation软件完成。打开分析软件,点击Select runs,选中运行完成的实验结果,然后依次点击Select evaluation method/Predefined/Binding screen/LMW screen-Kinetics,确认溶剂校正结果有效后,软件进行自动拟合。

结果与分析

  1. 通过大肠杆菌表达系统成功重组表达目的蛋白并进行了亲和纯化和分子筛纯化,SDS-PAGE鉴定产物纯度 > 95%。


    图9. 重组表达的NSP5蛋白的纯化结果图 (黑色箭头指示为目的蛋白条带)

  2. 利用氨基偶联的方法将目的蛋白固定在S系列CM5芯片的8个通道上,偶联量大约为12000 RU (见图3)。
  3. 通过Biacore8K+高通量互作分析系统的小分子高通量筛选程序LMW screen快速检测了抗COVID-19中药单体库的160个天然小分子。通过数据分析软件对实验结果进行了拟合,部分拟合结果如图10所示。由于高通量筛选,每个分析物小分子都是采用的单一浓度,拟合模型采用的是1:1结合模式。并且该筛选没有阳性对照,因此更倾向在拟合结果图中选择有结合响应值的小分子来进行进一步详细完整的动力学和/或亲和力的测定。


    图10. 对NSP5蛋白进行抗COVID-19中药单体库高通量筛选的部分结果拟合示意图

  4. 对于本次筛选实验通过分析软件中的On-off rate chart分析可以将蛋白与每个小分子结合强度显示为散点图 (图11),该图的纵坐标为结合速率(即进样阶段早期和晚期的响应值比率),横坐标为解离速率(即解离阶段早期和晚期的响应值比率),灰色斜线代表亲和常数KD。具有相同亲和力常数但相互作用的动力学会有不同。因此按照KD的强弱,再结合图10的结合解离曲线的拟合结果,挑选出小分子进行后续进一步测试。


    图11. 高通量筛选化合物库每个小分子对应的结合/解离速率散点图

失败经验

  1. PH Scouting是氨基偶联方法中的需要摸索的一个重要步骤。由于本方法采用的CM5芯片表面是羧甲基化葡聚糖,在PH>3.5条件下带负电,因此需要使目的蛋白所在的缓冲液PH在3.5和它的等电点之间,这样目的蛋白带正电,就可以富集到芯片表面以利于后续的氨基偶联反应。一般来说,PH越低蛋白预富集越多,但是也要考虑在低PH下蛋白的稳定性不佳(易发生聚集或沉淀),此外,氨基偶联需要自由氨基基团,因此在稍高的PH条件下偶联效率更高。所以需要在PH4-5.5之间以0.5PH步长进行条件摸索,根据预富集的结果选择最优的偶联条件。
  2. Startup cycles是不可或缺的,一般起始最少设置3个Startup cycles。它的设置是为了让系统按照方法设定的条件,以空白buffer进样进行至少三次模拟实验,使整个系统流路进入一个稳定的状态后在进行真正的进样实验。
  3. 溶剂校正:小分子溶解性较差,故需要加入一定浓度的DMSO 来溶解,否则进样后会造成通道阻塞。由于引入有机溶剂会对信号产生较大影响 (1% DMSO 可引起1200 RU的变化),在准备样品过程中DMSO浓度的微小变化引起的响应值变化会导致与小分子样品本身结合引起的响应值变化达到相同的数量级,因此需要加入溶剂校正来扣除有机溶剂的本体效应影响。溶剂校正曲线:进样一系列梯度浓度的DMSO空白样品(配制方法详见溶液配方9),用扣减参比的配体通道信号值对参比通道相对信号值作图就构成了一条校正曲线。溶剂校正曲线可以用来计算在参比通道相对响应值不同的情况下溶剂本体效应对最终结合信号的影响,并对最终结果加以校正。
  4. 所有溶液都需要经过过滤和脱气处理

溶液配方

  1. LB液体培养基
    称取25 g LB预混粉末,溶于1 L单蒸水,高压灭菌备用
  2. TBS缓冲液
    称取6.057 g Tris (MW:121.14),29.22 g NaCl (FW:58.44) 加入900 ml的去离子水,溶解后浓盐酸调pH至8.0,加去离子水定容至1 L,过0.45 μm的滤膜
  3. 1 M咪唑
    称取6.808 g咪唑 (MW:68.08) 加入80 ml Buffer1,溶解后浓盐酸调pH至8.0,加Buffer1定容至100 ml,过0.45 μm的滤膜
  4. Buffer1
    量取6 ml 1 M咪唑,加TBS缓冲液定容至300 ml
  5. Buffer2
    量取10 ml 1 M咪唑,加TBS缓冲液定容至200 ml
  6. Buffer3
    量取25 ml 1 M咪唑,加TBS缓冲液定容至100 ml
  7. Buffer4
    称取3.03 g Tris (MW:121.14),8.77 g NaCl (FW:58.44) 加入900 ml的去离子水,溶解后浓盐酸调pH至8.0,加去离子水定容至1 L,过0.22 μm的滤膜并脱气
  8. 1.05x PBS-P
    量取210 ml 10x PBS-P 用去离子水定容到2 L,过0.22 μm的滤膜并脱气
  9. 含有不同浓度DMSO溶液的配制
    9.1
    按照表1配制含4.5% DMSO和5.8% DMSO的PBS-P 溶液,以及5% DMSO的流动相缓冲液;

    表1. 溶剂校正溶液和流动相溶液配方表
    4.5% DMSO5.8% DMSO5% DMSO
    1.05x PBS-P9.5 ml9.5 ml950 ml
    100% DMSO0.45 ml0.58 ml50 ml
    终体积≈10 ml≈10 ml1,000 ml

    9.2
    按照表2配制四点校正的标准液

    表2. 四点校正标准液配方表
    1234
    DMSO浓度5.8%5.3%4.9%4.5%
    4.5% DMSO体积01,500 μl2 × 15,00 μl2 × 1,500 μl
    5.8% DMSO体积2 × 1500 μl2 × 1500 μl1500 μl0

    9.3
    50% DMSO缓冲液
    量取250 ml 100% DMSO,加去离子水定容至500 ml。

致谢

感谢清华大学结构生物学高精尖创新中心的经费支持和蛋白质研究技术中心蛋白质制备与鉴定平台提供仪器支撑服务。感谢北京协和医院张抒扬课题组栾晓东博士提供部分实验数据。

参考文献

  1. Giannetti, A. M. (2011). Chapter Eight - From Experimental Design to Validated Hits: A Comprehensive Walk-Through of Fragment Lead Identification Using Surface Plasmon Resonance. Methods in Enzymology 493: 169-218.
  2. Huber, S., Casagrande, F., Hug, M. N., Wang, L., Heine, P., Kummer, L., Pluckthun, A., and Hennig, M. (2017). SPR-based fragment screening with neurotensin receptor 1 generates novel small molecule ligands. PLOS ONE 12(5): e0175842.
Please login or register for free to view full text
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:常卿, 杨姊, 李文奇. (2021). 利用Biacore8K+高通量筛选靶向生物大分子的小分子活性物质. // 高通量筛选实验手册. Bio-101: e1010846. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010846.
How to cite: Chang, Q., Yang, Z., and Li, W. Q. (2021). High-Throughput Screening of Small-molecular Targeting Biomolecular by Biacore8K+. // High-throughput Screening Protocol eBook. Bio-101: e1010846. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010846.
Q&A

If you have any questions/comments about this protocol, you are highly recommended to post here. We will invite the authors of this protocol as well as some of its users to address your questions/comments. To make it easier for them to help you, you are encouraged to post your data including images for the troubleshooting.

If you have any questions/comments about this protocol, you are highly recommended to post here. We will invite the authors of this protocol as well as some of its users to address your questions/comments. To make it easier for them to help you, you are encouraged to post your data including images for the troubleshooting.

We use cookies on this site to enhance your user experience. By using our website, you are agreeing to allow the storage of cookies on your computer.