摘要:在一些高通量筛选实验中,细胞培养一定时间后,培养液营养成分和代谢产物逐渐变化,导致低PH环境,进而对细胞生长产生影响。另外,在诱导分化或其他特定表型出现的筛选体系中,也往往涉及更换不同成分培养液的操作。所以,实验者需要在无菌条件下对微孔板内细胞更换培养液,以维持细胞继续增长。传统方法需要通过排枪吸液和加液,耗时长,且易将贴壁不牢的细胞吸起,导致实验失败,合适的高通量仪器可以帮助实验者实现贴壁细胞换液操作。本文采用293-T细胞,细胞培养于384孔板,通过Bravo自动化液体处理平台,可以实现无菌条件下细胞换液,细胞贴壁不脱落,且不影响细胞状态,以期后续实验的顺利进行,为优化筛选体系中的换液操作提供参考流程。
关键词: 高通量筛选实验, 贴壁细胞换液, Bravo, 参数设置
材料与试剂
- DMEM培液 (HyClone, Catalog Number: SH 3024301)
- TRYPSIN-EDTA (0.25%) (Gibco, Catalog Number: 25200056)
- 384孔黑边底透板 (Corning, Catalog Number: 3764)
- 96孔PP材质板 (Corning, Catalog Number: 3879)
- 15 ml离心管 (NEST, Catalog Number: 601002)
- 50 ml离心管 (NEST, Catalog Number: 602002)
- Multidrop仪器标准管分液盒 (Thermo, Catalog Number: 24072671(0))
- 细胞计数片 (BodBoge细胞计数仪配置)
- 移液管 (Corning, Catalog Number: 4488)
- 100 mm细胞培养皿 (NEST, Catalog Number: 704001)
- 70 µl384孔Bravo仪器移液头盒 (Fluotics, Catalog Number: AGI-P70.ST)
仪器设备
- BodBoge细胞计数仪 (上海祥合医疗器械有限公司,型号: JSY-SC-021H)
- Multidrop Combi自动分液器 (Thermo Fisher Scientific,型号: Multidrop Combi)
- Bravo自动化液体处理平台 (Agilent Technologies,型号: Bravo)
- 高速离心机 (Eppendorf,型号: Centrifuge 5810R)
- Ensight多功能微孔板检测仪 (PerkinElmer,型号: Ensight Multimode Plate Reader)
- 37 °C恒温培养箱 (Thermo Fisher Scientific,型号: SERIES 8000 DH)
实验步骤
- 接种细胞
293-T细胞用胰酶消化后,悬浮于含10%胎牛血清DMEM培液的15 ml离心管中,取10 μl细胞悬液使用BodBoge细胞计数仪记取个数,然后计算细胞合适接种量,再使用Multidrop自动分液器,按每孔1,000个细胞接种于384孔板,微孔板每孔加入55 μl细胞液,129 × g离心2 min,然后放置于37 °C,5%CO2培养箱孵育72 h。
- 使用Bravo仪器进行细胞换液操作
- Ensight仪器成像
Bravo仪器运行结束后,将细胞板离心,129 × g,1 min,之后使用Ensight仪器成像。
结果与分析
使用Bravo自动化液体处理平台进行细胞换液包括两个步骤:1.从细胞板里吸培养液,2.往细胞板里加新鲜培养液。
对于吸液条件来说,当固定Aspirate Parameters条件,选择表1条件①,移液头在距细胞板底0.5、1和1.5 mm位置处,细胞均易被吸起,而在2 mm及以上位置处,细胞不易被吸起(图5),所以吸液参数Distance from well bottom可选择2 mm。
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图5. 设定细胞板内吸液Aspirate Parameters参数不变,变化Distance from well bottom进行吸液后孔内细胞状态图
当固定吸液参数Distance from well bottom为2 mm,依次变化Aspirate Parameters中速度和加速度,调节条件依次是表1条件①-⑥,发现当固定高度在2 mm处后,变化Aspirate Parameters条件①-⑥对细胞状态影响较小,均未将细胞吸起(图6)。
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图6. 设定从细胞板内吸液Distance from well bottom为2 mm,变化Aspirate Parameters参数进行吸液后孔内细胞状态图
考虑吸液时间及细胞状态等综合因素,吸液中设置Distance from well bottom为2 mm,Aspirate Parameters是表1中条件③,也即Velocity: 10 μl /s,Acceleration: 10 μl/s2。
固定好吸液条件后,随即选择Dispense Parameters表2条件中最低速度和加速度(见表2条件①,Velocity: 1 μl/s,Acceleration: 1 μl/s2),变化加液的Distance from well bottom的参数设置。我们发现,在移液头距细胞板底1 mm及以上处没有细胞脱落(图7)。根据实验稳靠性考虑,加液参数Distance from well bottom设置成2 mm。
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图7. 固定从细胞板内吸液Aspirate Parameters和Distance from well bottom,往细胞板里加液Dispense Parameters参数也不变,变化加液中Distance from well bottom进行加液后孔内细胞状态图
然后我们选择加液参数Distance from well bottom为2 mm,变化Dispense Parameters条件,设置从如表1条件①-⑥依次变化,调节至条件⑥(Velocity: 50 μl/s,Acceleration: 50 μl/s2),细胞会被吹起(图8),我们根据细胞状态及实验使用时间等因素考虑,Dispense Parameters选择表2条件③(Velocity: 10 μl/s,Acceleration: 10 μl/s2),Distance from well bottom选择2 mm。
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图8. 固定从细胞板内吸液Aspirate Parameters和Distance from well bottom,往细胞板内加液中Distance from well bottom不变,变化加液中Dispense Parameters参数进行加液后孔内细胞状态图
同时,我们还进行了对整块384孔细胞板进行吸液和加液的操作。如上所述,吸液条件:Distance from well bottom为2 mm,Aspirate Parameters是 Velocity: 10 μl/s,Acceleration: 10 μl/s2;加液条件:Distance from well bottom为2 mm,Dispense Parameters是 Velocity: 10 μl/s,Acceleration: 10 μl/s2。发现在这个条件下,整板293-T细胞也未被吸起。
所以,我们使用Bravo自动化液体处理平台对293-T细胞板进行换液操作,293-T细胞可以贴壁不脱落。
由本次实验可知,适当调节好从细胞板里吸液和往细胞板里加液的三个参数(1. Aspirate Parameters,2. Dispense Parameters,3. Distance from well bottom),是可以实现贴壁不牢细胞的换液操作的。
需要注意的是,根据前期实验摸索得到临界参数条件时,Distance from well bottom设置高度适当提高一些,Aspirate Parameters和Dispense Parameters中速度和加速度适当降低一些,这样可以保证实验的重复性。
另外,在吸液条件中,Distance from well bottom设置高度不同,细胞板内培养液剩余体积会不同,随移液头距细胞板底高度的提高,培养液剩余体积逐渐增多。如果实验者希望原始培液干扰实验影响降至最低,可以参照文中叙述距底高度条件,根据自身细胞特点,选择合适的距底高度,然后通过重复吸液加液操作,将原始培养液逐渐稀释,以此达到实验要求。
致谢
感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台的每位成员的帮助。
参考文献
- Masters, J. R. and Stacey, G. N. (2007). Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc 2(9): 2276-2284.
- 徐兰 和 刘敏英 (2009). 293T细胞的培养. 细胞生物学杂志(01): 130-130.
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Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:慈云青. (2021). 无菌条件下贴壁细胞换液的Bravo自动化液体处理平台参数设置. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010845. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010845.
How to cite: Ci, Y. Q. (2021). Parameter Setting of Bravo Automated Liquid Handling Platform for Adherent Cells Medium Exchange Under Sterile Condition. // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010845. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010845.