Dual Fluorescence Reporter-based siRNA Screening of Transcription Regulators of Response Elements   

材料与试剂

1. ON-TARGETplus Non-Targeting Pool (siNC-OTP, Dharmacon, catalog number: D-001810-10-05)
2. TOX Transfection Control (si-TOX, Dharmacon, catalog number: D-001500-01-05)
3. si-PC-1 (Genepharma, 20 μM)
4. si-PC-2 (Genepharma, 20 μM)
5. Opti-MEM (Gibco, catalog number: 31985088)
6. VPSFM (Gibco, catalog number: 11681020)
7. Lipofectamine RNAiMAX (Gibco, catalog number: 13778150)
8. Puromycin (Invivogen, ant-pr-5b)
9. Hygromycin (Merck, catalog number: 400052)
10. PEI (Polysciences, catalog number: 23966)
    
11. 小分子刺激物STI（使用DMSO为溶剂配成100 mM储存液）
12. DMSO (Sigma-Aldrich, catalog number: D4540)
13. DMEM (Corning, catalog number: 10013035)
14. FBS (Yeason, catalog number: 40130ES76)
15. 胰酶 (Gibco, catalog number: 25200072)
16. DPBS (源培，catalog number: K210704)
17. 5×siRNA buffer (Thermo Fisher, catalog number: B-002000-UB)
18. 16% PFA (Alfa Aesar, catalog number: 43368)
19. Hoechst 33342 (Invitrogen, catalog number: H3570)
20. 0.45 μm 滤器 (Sartorius Stedim, catalog number: 16533-K)
21. 一次性无菌注射器（上海康德莱企业发展集团股份有限公司，10 mL）
    
22. 0.5-10 μL排枪（BRAND, catalog number: SP0025）
23. 透明圆底96孔板 (Corning, catalog number: 3879)
24. 黑边底透384孔板 (Corning, catalog number: 3764)
25. 200目尼龙网
    

仪器设备

1. Operetta高通量细胞成像分析系统 (Perkin Elmer, Operetta)
2. Multidrop Combi 自动分液器 (Thermo Fisher, Multidrop Combi)
3. 通用型离心机 (HermLe, model: Z 300K)
4. 高速冷冻离心机 (Eppendorf, model: 5810R)
5. 干细胞多色流式检测仪 (Beckman, CytoFlex LX)
6. 荧光倒置显微镜 (Olympus, model: IX51)
7. 倒置相差显微镜 (Olympus, model: CKX31SF)
8. 二氧化碳细胞培养箱 (Thermo Fisher, model: 3111)
9. 全自动细胞分析计数仪 (Beckman Coulter, Z2)
10. 生物安全柜 (ESCO, model: FHC-1200A)
11. 离心式自动洗板机 (BlueCatBio, BlueWasher)
    

实验步骤

注：细胞中存在的一些信息分子（比如雌激素，cAMP，甲状腺激素等），当它们和对应的受体结合时，其受体可以与位于启动子上游的、一段特异的保守的DNA序列进行结合，启动下游基因的转录，这段序列被称作反应元件(response element, RE)。比如，雌激素(estrogen)受体结合的反应元件简称为ERE，甲状腺激素(thyroid hormone)受体结合的反应元件简称为TRE等。
由于这份protocol涉及到的筛选结果尚未发表，因此具体筛选的信号通路以及筛选时使用的刺激该信号通路的小分子都没有给出具体的信息，我用“RE”来指代筛选涉及通路的反应元件序列，而用“STI”来指代可以激活这条信号通路的信息分子。

一、构建稳转细胞系

1. 将所需要的片段RE、EGFP、SV40 polyA、SV40 promoter、Hygromycin Resistance(Hygro^r)等通过PCR扩增，酶切，连接接入pGL4载体中，得到pGL4-RE-EGFP-SV40 polyA-SV40 promoter-Hygror-SV40 polyA（以后简称为REPHP）质粒。
   注①:载体可以是pGL4或pGL3，这是双荧光素酶报告基因系统最常用的载体，也可用于GFP报告基因。与普通的真核生物表达载体(如pcDNA3.0)相比，它们减少了很多非特异的转录因子结合位点，可以降低检测背景，提高信噪比。
   
2. 准备一盘10 cm培养皿的SH-SY5Y细胞，在汇合度达到80%左右时进行转染，如图1A。在两个15 mL管中分别加入1.5 mL Opti-MEM培养基，向其中一管加入15 μg的REPHP质粒，向另一管加入45 μL PEI转染试剂，静置5 min后，将两管液体混合后使用移液器吹打混匀，室温静置20 min。吸除培养皿中的培养基，加入5 mL Opti-MEM培养基后，再将静置后的质粒-PEI混合液转移到培养皿中，置于37 °C二氧化碳细胞培养箱中培养，5小时后吸除Opti-MEM培养基，加入10 mL 含有10%FBS的DMEM培养基继续培养。转染24小时后，将长满的细胞用胰酶消化，按1比3传代到一盘新的10 cm培养皿中，此时培养基为含有100 μg/ mL Hygromycin的完全培养基（DMEM + 10% FBS）。
   注②：Hygromycin的使用浓度需要提前摸索，不同的细胞耐受程度不同。可以准备一盘6 cm培养皿的SH-SY5Y细胞，传代到12孔板中，传代时每个孔中加入含有不同浓度抗性的培养基（按储存浓度的1:100, 1:200, 1:500, 1:1,000, 1:2,000, 1:4,000, 1:6,000, 1:8,000稀释），72小时后观察，选择有95%以上细胞死亡的最低浓度为筛选时使用的浓度。传代时细胞对抗性的耐受度低，可以更有效的杀死不含有抗性基因的细胞。
   
3. 使用Hygromycin处理3天后，将细胞传代到6 cm培养皿中，使用含有100 μg/mL Hygromycin的培养基持续培养1-2周。
   注③：超螺旋结构的质粒，通常在转染后3天内会逐渐丢失，有很低的概率会随机整合到基因组中，形成稳转细胞株。为了提高质粒的整合效率，可以将质粒通过酶切的方式线性化后，再转染细胞。在选择酶的时候需要注意，线性化质粒所用的限制性内切酶不能破坏启动子、增强子、终止子等，不能影响目的基因的表达。3天后，由于游离的质粒从细胞中丢失，可以开始观察到细胞在逐渐死亡，剩余的细胞越来越少，而整合到基因组上的细胞则会活下来。Hygromycin杀死细胞的速度较慢，因此比Puromycin需要更长的起效时间。直到细胞可以在Hygromycin的筛选压力下正常生长，得到的就是在基因组内整合了Hygromycin抗性基因的细胞群。
   
4. 铺细胞于12孔板内，加入不同浓度（0.1 μM, 1 μM, 10 μM）的小分子刺激物STI，分别在处理24小时和48小时后，通过荧光显微镜观察表达EGFP的细胞数目以及EGFP的荧光强度。若随着STI的浓度升高，表达EGFP的细胞增多，且EGFP的亮度增强，则该细胞不仅整合了Hygromycin抗性基因筛选标记，而且可以通过EGFP的荧光强度来反映转录强度的变化。暂定名为REPHP细胞。
   
   
   图 1 细胞汇合度示意图.A. SH-SY5Y细胞（200×，标尺为500 μm）B. HEK 293T细胞（200×，标尺为500 μm）
   
   
5. 构建pCDH-CMV-mCherry-EF1A promoter-Puro^r质粒。PCR扩增mCherry表达基因，与慢病毒载体pCDH连接。在6孔板内培养HEK 293T细胞，当汇合度达到90%（图1 B）时进行转染。准备两个1.5 mL EP管，向每管加入250 μL Opti-MEM培养基，其中一管加入12 μL PEI，吹打混匀后静置5 min；另一管加入2 μg pCDH-mCherry质粒、1.2 μg δ8.91质粒、0.8 μg VSVG质粒，吹打混匀后，与静置后的、含有PEI的Opti-MEM混合，用移液器吹打混匀后，室温静置20 min。吸除6孔板中细胞培养基，向孔内加入1 mL Opti-MEM培养基后，再加入静置后的质粒-PEI混合液，在37 °C二氧化碳细胞培养箱中培养5小时后，将上清换为2 mL含10%FBS的DMEM培养基。转染24小时后，补充2 mL含10%FBS的DMEM培养基。转染48小时后，将6孔板内的细胞培养基全部转移到15 mL管中，约4 mL，此时培养基中含有包装成功的病毒，用作病毒液。采用孔径为0.45 μm的滤器过滤病毒液以去除残留的293T细胞。将提前一天接种在6孔板中的REPHP细胞培养基吸除，加入2 mL过滤后的病毒液进行感染，8小时后吸除病毒液，加入含10%FBS的DMEM培养基，24小时后，将细胞从6孔板中传代到6 cm培养皿内，在培养基中加入100 μg/mL Hygromycin和 2.5 μg/mL Puromycin。
   注④：Puromycin的使用浓度需提前按照注②的方式摸索。
   
6. 72小时后，在荧光显微镜下观察细胞表达mCherry荧光情况。此时，我们得到了在基因组中整合了RE-EGFP-Hygromycin与mCherry-Puromycin的细胞，暂定名为REHmCP细胞。
7. 将REHmCP细胞消化后，进行细胞计数，转移100-200个细胞到10 cm培养皿中，水平来回移动培养皿使细胞均匀分散，培养基为含有100 μg/mL Hygromycin和2.5 μg/mL Puromycin的完全培养基。在37 °C二氧化碳细胞培养箱中培养一周。细胞成团生长为单克隆。
   注⑤：由于在病毒感染或质粒随机整合到基因组上时，每个细胞被整合的基因拷贝数是不同的，所以每个细胞间的荧光强度存在差异，需要挑取单克隆。
   
8. 吸除培养基，用4 mL DPBS润洗细胞，吸除DPBS，用移液器吸取2 μL 胰酶，吹打单克隆，将脱离后的细胞转移到48孔板中，每个单克隆细胞团对应一个孔，孔内加入300 μL含100 μg/mL Hygromycin和2.5 μg/mL Puromycin的培养基。共挑取20个以上单克隆。在37 °C二氧化碳细胞培养箱中培养数日，直到培养基呈现黄色，且细胞已经超过孔底面积的50%。此时，将细胞消化后传代到24孔板内，继续培养，当细胞密度超过孔底面积70%时，将每孔细胞等分为2份，一份传代到12孔板，另一份传到24孔板内进行流式检测。用于流式检测的细胞，每株细胞等分到两个孔内，一个孔加入小分子刺激物STI使其终浓度达到2 μM，另一个孔加入相同体积的DMSO作为对照组，处理24小时。
   注⑥：除了挑取的各个REHmCP细胞株外，还需要野生型的SH-SY5Y细胞作为对照，以确定门的设定范围。
   
9. 当24孔板内的各个细胞株长满，胰酶消化，150 ×g 离心3 min，弃上清，加入500 μL DPBS吹打重悬，用尼龙网过滤为单细胞后，进行流式检测。
   9.1

   上机检测对照细胞SH-SY5Y。先用前向（FSC）和侧向（SSC）圈出活细胞群，横坐标为FSC-A，纵坐标为SSC-A。再去除黏连细胞，横坐标为FSC-A，纵坐标为FSC-H。如图2所示。最后用荧光通道设置阳性细胞群区域，横坐标为B525-FITC-A或Y610-mCherry-A，纵坐标为Histogram。
   
   
   图2. 流式检测圈门策略
   
   
   9.2

   对每个细胞株进行检测，选择绿色（FITC）与红色（mCherry）荧光强度均为单峰，且加入小分子刺激物后绿色荧光强度有明显增强、而红色荧光强度基本不变的细胞株。
10. 用流式软件统计每株细胞绿色荧光蛋白（GFP）的平均荧光强度，算出加入STI刺激前后，GFP荧光强度的比值大小，选择比值变化最大的细胞株进行后续siRNA文库筛选实验。

二、siRNA文库初筛

正式筛选实验开始前，请进行预实验，摸索最适的筛选条件（包括阴性对照siRNA的种类、转染试剂的种类和体积、细胞接种的密度等），见表1。

表 1 . 优化后的筛选条件

第一天

1. 将siRNA文库（384孔板）从-20 °C冰箱取出于室温解冻，分散放在桌面的吸水纸上。
   将文库移入超净台A中，擦净盖子内外侧的冷凝水。130 ×g离心1 min，将可能粘在膜上的siRNA甩入孔内。
   注⑦：若离心后仍有残余，可用800 ×g 离心1 min，若依然无法将液滴完全甩入孔内，则放弃。对实验结果不会有明显影响。
   
2. 将文库移入超净台A内，将板盖内侧朝上放置；将无盖的多孔板移入超净台B内。超净台A开紫外照射10 min。
3. 10 min后，将384孔板由超净台B转移到超净台A中，压住384孔板的边缘避免晃动，从一侧缓慢撕除覆盖的膜，将板盖盖好。
4. 用泵吸除每块板的第2列和第19列中的液体。
5. 稀释siRNA。在EP管内按照表2稀释好siRNA的阳性对照(positive control, si-PC，2个阳性对照都是敲低后可以抑制所研究的信号通路的基因)、阴性对照(negative control, si-NC)以及转染效率参照(si-TOX)。使用移液器吹打混匀后，转移150 μL到96孔板的对应孔（表3），再用排枪从96孔板转移10 μL到384孔板的第2列和第19列（表4）中。
   本次筛选文库含有6块384孔板。96孔板的每个孔对应384孔板的2孔*6块板=12孔。384孔板的每个孔对应 0.05 μL siRNA + 9.95 μL siRNA buffer。为了避免转移时出现损失，按照1个96孔板的孔对应384孔板的15个孔（非12孔）计算，每个96孔板的孔应该含有0.75 μL siRNA+149.25 μL siRNA buffer，共150 μL 混合液。同样，为了避免从EP管向96孔板中转移出现损失，在配制EP管中的液体时，用于计算的孔数会比实际的孔数多（见表2第2列和第3列）。
   
   表 2. 稀释每种siRNA对应的体积
   
   
   表 3. 96 孔板的版型分布
   
   
   表 4. 384孔板的版型分布
   
   
   
6. 在50 mL管中，用26 mL Opti-MEM培养基稀释130 μL RNAiMAX转染试剂，静置5 min。
7. 采用超净台内Multidrop仪器的small cassette，将稀释后的转染试剂，按照每孔10 μL的体积，加入到每块384孔板的第2-19列中。130 ×g离心1 min。室温静置20 min以上，充分形成siRNA-转染试剂复合物。
   一块板按照340个孔计算，共有6块板，则按7块板来算，340 × 7=2380孔，每孔的体积为0.05 μL RNAiMAX + 9.95 μL Opti-MEM培养基，共10 μL，则需要23.8 mL。Multidrop仪器的small cassette的死体积为1 mL，所以使用26 mL Opti-MEM培养基稀释转染试剂RNAiMAX，需要的RNAiMAX的体积为0.05 μL/10 μL*26,000 μL=130 μL。
8. 使用胰酶消化REHmCP细胞，150 ×g离心3 min，弃上清。用1 mL 含有10% FBS的VPSFM培养基重悬。进行细胞计数。
   注⑧：摸索条件与正式实验时，应该用相同的仪器或设备进行细胞计数，以保证实验结果的可重复性。比如，摸索条件时若使用的是细胞计数板，那么正式实验时也要用同一个细胞计数板进行细胞计数。
   这里使用的VPSFM培养基，全称是Virus Production Serum-free Medium，是无血清超低蛋白培养基，不含蛋白质、肽或其它动物或人来源的成分。使用这种培养基，是因为此前摸索过培养基的血清浓度（1%-10%），而该培养基能够在低血清的浓度下比普通的DMEM更有利于细胞存活。但最终发现，10%FBS +VPSFM是最好的条件。因此，我们推测，可能使用DMEM+10%FBS进行筛选也是可以的，不一定非要使用VPSFM。
   
9. 按照之前优化的筛选条件，每孔对应5,500个细胞和30 μL VPSFM+10% FBS培养基，根据孔的数量计算所需的细胞量。
10. 准备好超净台内的Multidrop仪器，使用standard cassette，先在每块板的第1列、第20列中，加入60 μL VPSFM + 10% FBS培养基，以抵消边缘效应。再在第2-19列的每孔内加入30 μL细胞悬液。孔内液体总体积为50 μL。
11. 将384孔板平稳地转移至恒温培养箱中进行培养。
    

第三天（转染48小时后）

1. 加入适当体积的小分子刺激物STI于VPSFM培养基中，使小分子刺激物的浓度达到20 μM，且溶剂DMSO的含量不超过1%。
2. 准备超净台内Multidrop仪器的small cassette，向384孔板的第2-19列的孔内加入5.5 μL稀释后的小分子刺激物STI，使终浓度达到2 μM，且溶剂DMSO终含量不超过0.1%。
3. 130 ×g离心1 min，将384孔板转移至培养箱中继续培养。
   

第四天（转染72小时后）

1. 准备细胞房外Multidrop仪器的small cassette，向384孔板第2-19列的孔内加入18.5 μL的 16% PFA，使PFA的终浓度达到4%。
2. 130 ×g 离心1min，室温静置固定30 min。
3. 准备细胞房外Multidrop仪器的standard cassette，按照1:750的比例，用PBS缓冲液稀释Hoechst 33342染色液，包好锡箔纸避光。
4. 使用Bluewasher洗板机去除细胞上清，PBS缓冲液清洗细胞。清洗程序选择“light spin wash”，循环次数为2次，体积为70 μL，管道为Blue Channel。
5. 用Multidrop仪器向清洗后的孔板中，每孔加入30 μL 稀释后的Hoechst 33342染色液，130 ×g离心20 s。
6. 用锡箔纸包裹离心后的多孔板避光，室温静置染色20 min。
   注⑨：其余板离心后室温避光染色20 min后，在4 °C避光保存。拍摄之前半小时从4 °C取出平衡到室温。
7. 用酒精湿润过的无尘纸擦拭384孔板底面，将其放入Operetta仪器中进行图像采集。共设置三个通道，分别是GFP, mCherry和Hochest。拍摄时选择中间3个视野。
8. 图像采集后，根据孔内细胞的实际情况，调整分析方法，设置合适的阈值区分孔内细胞与背景，尽量选中所有的细胞。分析图像中的EGFP与mCherry的荧光强度，还有Hoechst对应的细胞数目，以得到每个孔细胞的相对荧光强度（荧光强度/细胞数目）。
   

结果与分析

1. 根据流式检测结果挑选细胞株。细胞株应该具有以下特点：（1）GFP和mCherry的峰图应该是单一且窄的峰。（2）加入小分子刺激物STI后，GFP荧光强度增强，峰向右侧移动；而mCherry的荧光强度基本不变，峰的位置不发生改变。
   图3是选出的阳性细胞株的流式结果。Control是未进行过任何处理的SH-SY5Y细胞，DMSO组是REHmCP细胞株用DMSO处理24小时，而STI组是用2 μM小分子刺激物STI处理24小时后的同一株细胞。细胞在mCherry通道（Y610-MCHERRY）和GFP通道（B525-FITC）的平均荧光强度见表5。
   这株细胞的mCherry荧光强度，在经过2 μM STI刺激后，几乎没有变化，表明mCherry可以作为内参；而GFP的荧光强度，在2 μM STI刺激后，升高为对照组的两倍，表明在GFP启动子区域的调节序列RE，可以响应STI引起的转录增强，即可以通过GFP的荧光强度来反映该通路转录活性的变化。
   
   表 5. 细胞内mCherry与GFP的平均荧光强度
   
   
   
   图 3. 用于筛选的阳性细胞株的mCherry与GFP的荧光强度
   
   
2. 图4为第一块板的E2孔（si-NC）与E19孔（si-PC-2）中间一个视野的图像。如图所示，阴性对照（si-NC）孔EGFP的荧光强度明显高于阳性对照（si-PC-2）孔，阴性对照孔的细胞数量也明显高于阳性对照孔，所以需要对所有细胞的相对荧光强度而不是视野中的荧光总强度进行比较。
   
   
   图 4. 阴性对照孔与阳性对照孔的三个通道的示例图
   
   
3. 通过Operetta软件对图片进行分析，流程为“Find Nucleus”，“Find Cytoplasm”，“Calculate EGFP Intensity”，“Calculate mCherry Intensity”。图5为软件分析时，选择合适的程序与阈值之后，对图片中的细胞进行寻找和统计。表6是经过软件计算后的各参数，第1列是“孔号”，第2列是“所圈细胞数目”，第3列是“所圈细胞的平均EGFP荧光强度”，第4列为“所圈细胞的平均mCherry荧光强度”。阳性对照孔E19的GFP强度约为阴性对照孔E2的41%，而mCherry的荧光强度则没有明显差异，提示GFP荧光强度的降低，是由于反应元件RE特异调节的信号通路的转录受到抑制而引起，而抑制作用则来自敲低PC-2基因，由此推测，PC-2是调节该通路的关键蛋白，与之前的结论相吻合。
   
   
   图 5. Operetta 软件分析过程示意图
   
   表 6. 软件计算的各参数值
   
   
   
4. 将图像分析的结果导出到Excel软件后，先对每块板的结果分别进行分析。从C行开始，到N行为止，将第2列到第19列每个孔的孔号“Well Name”、去除背景后的EGFP平均荧光值“Nuclei-EGFP Mean”、去除背景后的mCherry平均荧光值“Nuclei-mCherry Mean”，转移到一张新的工作表A中，排成3列。
5. 根据版型排布，将阴性对照孔和阳性对照孔的上述三个参数的值挑出，分别计算它们的平均值（mean）、标准偏差（SD，函数为STEDV）、变异系数（CV，公式为SD/mean*100%）,以及阳性对照孔的Z'值（Z'=1-3*(阴性SD+阳性SD)/(阴性mean-阳性mean)。如果CV小于10%或者Z'值大于0.2，则认为是比较稳定的筛选结果。图6是阳性对照si-PC-2在每一块板的CV与Z'值，其中每块板的CV都小于10%，并且大部分板的Z'值大于0.2，这说明本次筛选结果的稳定性较好。
   
   
   图 6. 各筛选板阳性对照孔si-PC-2的CV与Z’值
   
   
6. 因为每条siRNA的3个复孔分布在3块不同的384孔板，为了比较不同板的数据，需要对每块板的数据进行标准化(normalization)处理，即某块板上每个孔的荧光值，都需要除以这块板的阴性对照孔的平均荧光值，得到标准化后的绿色荧光强度值 “Normalized-GFP “ 与标准化后的红色荧光强度值“Normalized-mCherry“。
7. 建一个新的工作表B，包含siRNA靶向的基因名、siRNA在三块板的3个复孔对应的Normalized-GFP值这4列，并算出其平均值（mean）、P值（P value）以及 -LOG10(P value)值。同时，将每个阴性对照孔和阳性对照孔的三次重复的复孔对应的Normalized-GFP值也列出。P值的计算需要用到T.TEST函数“T.TEST （每条 siRNA对应的3个 复孔的Normalized-GFP，所有阴性对照孔的Normalized-GFP，2，3）”，其中，“2”的意思是双尾检验，“3”为双样本异方差假设。
   此外，该工作表B中列出siRNA在三个复孔中的Normalized-mCherry值，并求出其平均值。因为mCherry只是作为参照，所以无需计算P值。
8. 建立新的工作表C，用于作图，包含siRNA靶向的基因名称、Normalized-GFP的平均值、P value以及-LOG10(P value)值，以及Normalized-mCherry平均值。以Normalized-GFP 平均值与-LOG10 (P value)值做散点图（火山图）。
9. Hits孔的选取：
   将siRNA对应的基因按照P value从小到大排序，P value <0.05认为是有显著差异的基因，选择这些基因，再将其按照Normalized-GFP mean值从小到大排序。
   至于Hits孔所在范围，通常是用除了对照孔以外的所有孔的Normalized-GFP的mean值和所有孔的SD值进行计算，选择平均值大于等于mean+5*SD、小于等于mean-5*SD区间范围内的基因作为hits。阳性对照PC-1和PC-2的孔的平均值，应该落在这个范围内。
   为了排除RE-EGFP的荧光强度的降低或升高是由广谱的转录或翻译抑制或激活引起的，而非所研究的信号通路特异性变化，可以将作为内参的mCherry的荧光强度平均值引入。计算Hits孔EGFP/mCherry的值，选择比值依然较小或较大的基因（可以参考阴性对照孔的比值的平均值，比最高值大或比最小值低的则可以接受）。
   

注意事项

1. 在挑选细胞株的时候，可能会有不止一个细胞株具备“荧光为单峰且加入刺激小分子后荧光强度变化较大”的特点，这时可以对不同细胞株进行siRNA筛选预实验，使用阳性与阴性siRNA进行处理，看每个细胞株在siRNA筛选体系中的表现（CV与Z’值）。因为即便用流式检测的方式得到的荧光强度变化很接近的细胞株，在siRNA筛选体系下，也会出现较大的差异。
2. 合适的细胞接种密度，最好是当细胞转染72小时后进行检测时达到70%-80%，如果太密，Operetta软件进行分析的时候，会出现无法区分信号与背景的情况，此时就无法准确的设定圈细胞的阈值。我本次实验的细胞密度其实有些偏高，细胞挤在一起会细胞与细胞之间的边界不清晰，软件在分析细胞数目时会比实际偏少，但是由于统计的是GFP平均荧光强度，所以对最后的结果没有造成明显影响。
   

溶液配方

1. PBS缓冲液
   NaCl 8 g
   KCl 0.2 g
   Na₂HPO₄·12H₂O 1.54 g
   KH₂PO₄ 0.2 g
   去离子H₂O 1 L
   用盐酸调节pH为7.4
   

致谢

该研究得到了国家自然科学基金(91853128, 31900804)、科技部(2018YFA0508200)、中国科学院战略重点研究计划(XDB19040102)、博士后科学基金(2018M642109, 2020M670976)的资助，受到了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台、细胞分析技术平台及分子生物学技术平台的大力支持。

参考文献

1. Lingemann, M., McCarty, T., Liu, X., Buchholz, U. J., Surman, S., Martin, S. E., Collins, P. L. and Munir, S. (2019). The alpha-1 subunit of the Na+,K+-ATPase (ATP1A1) is required for macropinocytic entry of respiratory syncytial virus (RSV) in human respiratory epithelial cells. PLoS Pathog 15(8): e1007963.
2. Sun, J., Katz, S., Dutta, B., Wang, Z. and Fraser, I. D. (2017). Genome-wide siRNA screen of genes regulating the LPS-induced TNF-alpha response in human macrophages. Sci Data 4: 170007.