摘要:环形RNA (circular RNA, circRNA) 主要是由前体RNA的外显子通过反向剪接产生的共价闭合的RNA分子。目前关于circRNA的表达调控和生物学功能仍不清楚。尽管已知部分顺式原件参与了circRNA的生成调控,但对于参与其中的反式因子仍知之甚少。为了全面评估与鉴定参与circRNA表达调控的反式因子,我们利用商业化的全基因组siRNA文库,结合生化细胞所化学生物学平台的高通量筛选平台,进行了全基因组siRNA筛选,最终鉴定到了103个参与circRNA表达调控的反式因子,并对其中鉴定到的两个蛋白NF90和NF110进行了深入的机制与功能研究。 这里,我们将详细介绍利用全基因组siRNA文库筛选circRNA表达调控反式因子的主要流程,包括筛选用细胞系的构建、全基因组siRNA文库筛选和数据分析流程。
关键词: RNAi筛选 , circRNA, 反式因子, RNA结合蛋白
材料与试剂
- HeLa细胞 (ATCC,产品目录号:CCL-2)
- HEK293细胞 (ATCC,产品目录号:CRL-1573)
- DMEM (GibcoTM, 产品目录号: 11965092)
- Fetal bovine serum (FBS) (GibcoTM, 产品目录号: 10270-106)
- 0.25% Trypsin (GibcoTM, 产品目录号: 27250018)
- Penicillin streptomycin (Hyclone, 产品目录号: SV30010)
- Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (GibcoTM, 产品目录号: 31985070)
- LipofectamineTM 3000 Reagent (Thermo, 产品目录号: 21341)
- LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent (Thermo, 产品目录号: 13778030)
- Human ON-TARGETplus siRNA library –Genome- SMARTpool (Dharmacon)
- doxycycline (Dox) (Clontech, 产品目录号: #631311)
- psPAX2 (Addgene, 产品目录号: #12260)
- pMD2.G (Addgene, 产品目录号: #12259)
- 84消毒液
- Phosphate buffered saline (PBS) 缓冲液 (见溶液配方)
仪器设备
- 高内涵细胞成像分析仪Operetta (PerkinElmer,Operetta高内涵细胞分析系统)
- 自动化洗板机ELx405 (BioTek,ELx405 Select Deep Well Microplate Washer)
- 自动化分液仪 Multidrop Combi (Thermo Fisher,Multidrop Combi自动化分液仪)
- CO2培养箱 (Thermo Fisher,Heracell 150i)
- 水平离心机 (Beckman Coulter, model: Allegra X-12R)
实验步骤
一、构建筛选用细胞系:可诱导的circmCherry-EGFP 报告细胞系 (图1)
图1. 可诱导circmCherry-EGFP 报告细胞系的构建流程
- 构建可诱导的circmCherry-EGFP 报告质粒
通过分子克隆,在p23-phage 质粒的基础上插入可以过表达circmCherry和EGFP的序列。另外,为了减少背景并更好的反应新生成的环形RNA表达量的变化,将CMV 启动子替换为Dox诱导表达的pTET启动子。可诱导circmCherry-EGFP 报告质粒的具体序列见Addgene, 产品目录号: # 92351。 - 包装可诱导circmCherry-EGFP 报告质粒的慢病毒
- 在HeLa传代过程中,将上述包装好的慢病毒加入DMEM完全培养基中,悬浮感染HeLa细胞。
- HeLa细胞感染4天后,加入1 μg/mL dox诱导circmCherry和EGFP表达。诱导表达24小时后,通过流式分选同时带有绿色荧光和红色荧光的HeLa细胞。
- 将流式分选拿到的同时带有绿色和红色荧光的HeLa细胞收集,并以每500个细胞接种到一个10cm培养皿里面,培养箱正常培养10天后,单个细胞来源的克隆长大至肉眼可见,再将单克隆分别转移至多孔板里面单独培养扩增。后续进一步挑选带有合适绿色、红色荧光的细胞系,即为筛选用的可诱导circmCherry-EGFP 报告细胞系。
二、全基因组siRNA文库筛选 (图2)
图2. Human siGENOME SMARTpool siRNA library 筛选流程
经过前期转染条件的优化,确定最适转染条件为:在384孔板中,使用LipofectamineTM RNAiMAX 0.1 μl/孔,细胞接种密度 500个/孔,转染48 h后,加入1 μg/mL dox诱导24 h,然后进行荧光表型检测。
siRNA转染的具体操作步骤如下:
- 阴性对照组的制备:
- 转染试剂的制备:
- 细胞悬液的制备:
- 将加好转染试剂和细胞的384板经水平离心机中100 × g离心2 min,放置于CO2培养箱中培养48 h。
- 将Dox用DMEM完全培养基稀释至6 μg/ml。使用自动化分液仪 Multidrop Combi将Dox加入siRNA板 (第1列至第24列),10 μl/孔。
- 将加好Dox的384板经水平离心机中100 × g离心2 min,放置于CO2培养箱中继续培养24 h。
三、表型检测
- 加入Dox 24 h后,使用PBS及自动洗板机ELx405清洗细胞3次 (抽吸30 μl 1x PBS并补充新的30 μl 1x PBS,重复3次),最后将培养基置换为1x PBS;此步骤的目的是降低由培养基导致的成像背景信号值过高,从而提高图像信噪比。
- 使用Operetta高内涵成像分析仪对清洗后的384板成像 (10倍长工作距离物镜,GFP和mCherry双通道) (图3)。
- 利用Harmony软件进行图像定量分析,分别计算各孔GFP和mCherry的平均荧光强度。
图3. 筛选结果中代表性的384孔板成像图片
结果与分析
筛选的384板经Operetta成像的结果中,第2列为Scramble组 (阴性对照组);第3列至第22列为siRNA处理组。成像数据经Operetta采集、自动化分析可得出量化的荧光数值,这些数据经过合理的分析 (图4) 得到初步的筛选结果,具体流程如下:
图4. 筛选结果的初步数据分析步骤及结果
- 利用Scramble组的GFP和RFP荧光值分别标准化各siRNA处理组的荧光值。将两次生物学重复的筛选结果值取平均,总共18,104个基因具有荧光值。
- 根据HeLa的RNA二代测序结果去除初步筛选结果中不表达的基因,保留9,249个表达基因的荧光值。
- 去除影响EGFP表达的基因,阈值设定为:0.67 < EGFP < 1.5,保留6,876个基因的荧光值。
- 筛选影响mCherry的基因:上调的阈值设定为:mCherry > 1.5,下调的阈值设定为:mCherry < 0.67,总共筛选到787和1,053个基因分别导致红色荧光上调和下调。
- 为了鉴定直接影响circRNA的反式因子,对找到的787和1,053个基因进行基因聚类分析,最终鉴定到103个RNA结合蛋白。
- 后续利用其他方法进行单个验证。 例如,通过shRNA敲低筛选鉴定到的NF90和NF110两个蛋白,均能发现circmCherry的表达量明显下调(图5),说明这两个蛋白对于circRNA的生成有促进作用,与筛选结果一致。
图5. 筛选结果的初步验证。敲低NF90和NF110影响了circmCherry的表达。
溶液配方
- 1x PBS,配置后调整pH值为7.2 ~ 7.4并过滤灭菌
NaCl
| 8 g
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Na2HPO4
| 2.9 g
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KCl
| 0.2 g
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KH2PO4
| 0.2 g
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ddH2O补至1 L |
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致谢
本实验在生化细胞所化学生物学平台完成,得到化学生物学平台工作人员的大力帮助。另外本实验得到了中国科技部 (2016YFA0100701、2014CB964802)、中国科学院 (XDB19020104)、国家自然科学基金 (91440202、91540115)和霍华德·休斯医学研究所 (55008728) 的支持。此方法已被使用,相应研究成果被发表在Molecular Cell (Li et al., 2017)。
参考文献
- Li, X., Liu, C. X., Xue, W., Zhang, Y., Jiang, S., Yin, Q. F., Wei, J., Yao, R. W., Yang, L. and Chen, L. L. (2017). Coordinated circRNA biogenesis and function with NF90/NF110 in viral infection. Mol Cell 67(2): 214-227 e217.
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Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:李响, 陈玲玲. (2021). 全基因组siRNA法筛选环形RNA的反式调控因子. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010820. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010820.
How to cite: Li, X. and Chen, L. L (2021). Genome-wide siRNA Screen for
trans-factors of Circular RNA Regulation. // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010820. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010820.