In-situ Hybridization for Mouse Brain Sections   

材料与试剂

1. 去离子水 (Milipore)
2. 经焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理的去离子水
3. 4%多聚甲醛 (PFA)
4. 经DEPC处理的磷酸盐缓冲溶液 (PBS) (pH 7.4-7.5)
5. 20%, 30%蔗糖 (Invitrogen, catalog number: 15503-022) 溶液 (经DEPC处理的1× PBS配制)
6. OCT包埋剂 (SAKURA, catalog number: 4583)
7. 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) (BBI, catalog number: A600194-0500)
8. 盐酸 (HCl) (生工，catalog number: 10011018)
9. 三乙胺醇 (TEA) (1M) (VETEC, catalog number: V900257)
10. 蛋白酶K (ThermoFisher, catalog number: 25530-049)
11. 抗地高辛碱性磷酸酶 (Anti-DIG-AP) (Roche, catalog number: 11093275910)
12. RNA探针
13. 100%甲醇 (沪试，catalog number: 10014118)
14. 封片剂 (碧云天，catalog number: P0126)
15. 柠檬酸钠缓冲液 (SSC) (pH 7.0)
16. PK缓冲液 (见溶液配方)
17. 杂交溶液 (见溶液配方)
18. 缓冲液B1 (见溶液配方)
19. 缓冲液B2 (见溶液配方)
20. 缓冲液B3 (见溶液配方)
21. 缓冲液B4 (遮光贮存) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 冰冻切片机 (Leica, catalog number: CM1950) (图1A)
2. 防卷板 (Leica, 14047742497)
3. 量筒 (申玻)
4. 杂交炉 (UVP，catalog number: HL-2000) (图1B)
5. 桌面离心机 (Thermo Fisher，catalog number: 75002420) (图1C)
6. 金属浴 (奥盛，catalog number: MK2000-2E) (图1D)
7. 脱色摇床 (QILINBEIER，catalog number: TS-1) (图1E)
8. 磁力搅拌器 (SCILOGEX，catalog number: MS7-H550-Pro)
9. 水浴锅 (精宏，catalog number: DK-S24)
10. 盖玻片 (Fisherbrand，catalog number: 12-544-E) (图2A) (或：Electron Microscopy Sciences，catalog number: 70329-60；或：LifterSlip，catalog number: 100499-626)
11. 载玻片 (Fisherbrand，catalog number: 12-550-15) (图2B)
12. 阻水笔 (ImmEdge，catalog number: H-4000) (图2C)
13. 杂交盒 (LOCK & LOCK) (内置海绵) (图2D)
14. 去离子水盒 (LOCK & LOCK) (内置海绵) (图2E)
15. 塑料染色缸 (生工，E678012) (载玻片数量多时可用) 或50 ml离心管 (Thermo Fisher，339652) (载玻片数量少时可用) (图2F, G)
16. 培养箱 (精宏，catalog number: SHP-250)
    
    
    图1. 实验所需仪器. (A) 切片机；(B) 杂交炉；(C) 离心机；(D) 金属浴；(E) 脱色摇床
    
    
    图2. 实验所需用品. (A) 盖玻片；(B) 载玻片；(C) 阻水笔；(D) 杂交盒；(E) 去离子水盒；(F) 塑料染色缸；(G) 50ml离心管
    

实验步骤

注：步骤1、2中所有试剂需保证无RNA酶，具体配方见附录，操作时需佩戴口罩、手套，穿好实验服，实验台面使用75%乙醇擦拭，以避免RNA酶污染。

1. 原位杂交准备：组织切片
   
   1.1

   原位杂交前，需要先通过浸泡或灌注的方式固定组织。胚胎或小块的组织可使用4% PFA在4°C浸泡过夜固定。对于大块的成年小鼠组织，如脑组织，则使用1× PBS及4% PFA灌注固定并使用4% PFA在4°C过夜完成后固定。
   1.2

   固定完成后，将组织转移到盛有1× PBS的离心管中，反复颠倒润洗3次，以去除组织表面残留的PFA。
   1.3

   用20%蔗糖溶液去除水分使组织脱水 (约1 d)，组织沉底后换用30%蔗糖溶液脱水至沉底 (约1-2 d)。
   1.4

   将组织擦干后放置于合适大小的模具中，缓慢加入OCT包埋，使OCT完全浸没过组织。
   1.5

   快速将冷冻的组织放置于-80°C下保存，直至切片操作。(或者直接进行冰冻切片)
   1.6

   取出要切片的组织，将其放置于冰冻切片机中至少30 min，使之复温。切片温度通常约为-20°C。
   1.7

   在冰冻切片机中进行组织切片 (厚度为12-22 μm)，将组织切片展平并贴附到载玻片上。
   1.8

   原位杂交前，贴有组织切片的载玻片需要在室温下晾置2 h，再置于50°C干燥15 min，以防切片从载玻片上脱落。需要供以后使用的冷冻组织切片应在室温下干燥大约1 h，随后置于-80°C保存，使用其进行原位杂交前在室温干燥1 h，随后50°C干燥15 min。


2. 原位杂交-第一天：
   

   注：染色缸 (离心管) 需用去离子水清洗后放入60°C烘箱烘干，使用前用DEPC处理的去离子水润洗3次。量筒、盖玻片用前需在180°C烘箱中放置2 h。

   2.1

   在染色缸中配制3份200 ml 1× PBS ①②③、1份PK缓冲液、1份1× TAE缓冲液和1份4% PFA。(若使用离心管，每份溶液配制25 ml即可，下同)
   2.2

   在50°C下干燥玻片15-30 min。
   2.3

   常温下，将玻片浸泡于4% PFA中，固定20 min。
   2.4

   常温下，将玻片浸泡于1× PBS①中润洗，然后使用另一份1× PBS②洗5 min。
   2.5

   常温下，将玻片浸泡于含有蛋白酶K的PK缓冲液中润洗10 min。
   2.6

   常温下，将玻片浸泡于1× PBS②中润洗一次。
   2.7

   常温下，将玻片浸泡于4% PFA中固定10 min。
   2.8

   常温下，将玻片浸泡于1× PBS①中润洗，然后用另一份1× PBS②洗5 min。
   2.9

   常温下，将玻片浸泡于0.1 M TEA缓冲液中，处理10 min。
   注：使用磁力搅拌装置，适当转速，也可放于摇床。
   2.10

   常温下，将玻片浸泡于1× PBS②中润洗，然后在1× PBS③中处理5 min。
   2.11

   常温下，将浸泡在1× PBS③中的玻片取出，用纸擦干背面，轻轻敲击载玻片边缘以减少残留的PBS，将载玻片平放到杂交盒中，在组织上滴加预杂交液使其完全浸没组织 (快速操作，保持组织切片湿润)，盖好盒盖，进行1 h的预杂交(图3)。
   
   
   图3. 预杂交示意图. (A) 将载玻片平放于杂交盒中；(B) 在玻片上滴加预杂交液使其完全覆盖组织。
   
   
   2.12

   将RNA探针加入杂交液中 (杂交液包含0.1-0.2 ng/μl的RNA探针)，在金属浴中85°C处理5 min，使RNA探针成为线性，然后迅速放到冰水混合物上冷却，混匀离心。
   2.13

   用移液枪吸去玻片上的预杂交缓冲液，每张玻片滴加约100 μl杂交液，盖上盖玻片以防止液体蒸干 (图4)。将玻片置于杂交盒中，盖好盒盖，在65°C的杂交炉中继续孵育过夜 (12-16 h)。
   
   
   图4. 探针杂交示意图.(A) 将预杂交液替换为杂交液，盖上盖玻片；(B) A图的放大图，显示盖玻片位置。
   
   
3. 原位杂交-第二天：
   
   3.1

   在染色缸中配制4份200 ml 0.2× SSC、2份200 ml缓冲液B1。
   3.2

   水浴锅中预热3份0.2× SSC至65°C。将载玻片直立，使盖玻片自然滑下。将载玻片浸泡于0.2× SSC溶液中，每份中各洗一次，每次20 min (快速操作，保持组织切片湿润)。
   3.3

   常温下，将载玻片转移到第四份0.2× SSC中，润洗5 min。
   3.4

   常温下，将玻片浸泡于缓冲液B1中，润洗2次，每次5 min。
   3.5

   用纸擦拭玻片边缘，用阻水笔在玻片上画疏水圈 (快速操作，保持组织切片湿润)，平放玻片，每张玻片滴加约200 μl缓冲液B2，使其完全覆盖组织。将玻片转移至水盒中，盖好盒盖，常温下封闭1 h (图5)。
   
   
   图5. 封闭示意图. (A) 用阻水笔在组织周围画疏水圈；(B) 在疏水圈内滴加缓冲液B2，平放于水盒中。
   
   
   3.6

   用移液枪吸去玻片上的缓冲液B2，滴加缓冲液B2+anti-DIG-AP (1:5,000) (每张玻片约200 μl)。将玻片转移至水盒中，盖好盒盖，4°C继续孵育过夜。


4. 原位杂交-第三天：
   
   4.1

   在染色缸中配制3份200 ml 缓冲液B1、2份200 ml缓冲液B3。
   4.2

   常温下，将玻片浸泡于缓冲液B1中润洗3次，每次20 min。
   4.3

   常温下，将玻片浸泡于缓冲液B3中润洗2次，每次5-10 min。
   4.4

   在玻片上滴加200 μl缓冲液B4。
   4.5

   将所有载玻片平放在水盒中，放入28°C培养箱，避光孵育10 min-1 d (显色时间与样品年龄、组织类型以及探针有关，待信号明显且背景没有明显升高时即可停止反应) (图6)。
   
   
   图6. 显色结果示意图. (A) 用Fezf2探针显色成功的脑片展示图。可见皮层深层的蓝紫色信号，且背景较低。(B) (A) 图方框所示区域的放大图。比例尺：(A) 200 μm, (B) 20 μm。
   
   
   4.6

   常温下，将玻片浸泡于去离子水中终止反应。
   注：如有必要，可将玻片浸泡于100%甲醇中15-30min，以降低背景。不要将INT/BCIP显色的玻片放入甲醇中。
   4.7

   用封片剂封片。

溶液配方

1. DEPC处理的去离子水 (室温保存)
   去离子水中加入0.1% DEPC，摇匀，避光过夜，灭菌处理。
   


2. DEPC处理的10× PBS (室温保存)
   

   药品	分子式	分子量	储存浓度		1 L所需
   氯化钠	NaCl	58.44	1.54 M		90 g
   七水合磷酸氢二钠	Na2HPO4·7H2O	268.07	0.03 M		7.95 g
   磷酸二氢钾	KH2PO4	136.09	0.01 M		1.44 g

   加入0.1% DEPC，摇匀，避光过夜，灭菌处理。
   


3. 4% PFA (-20°C保存)
   

   药品	分子式	分子量	工作浓度	500 ml所需
   DEPC处理的10× PBS	\	\	1x	50 ml
   多聚甲醛	(HCHO)n	(30.03) × n	4%	20 g
   DEPC处理的去离子水	H2O	18	\	补足500 ml

   65°C加热，完全溶解后过滤。
   


4. 1 M三乙醇胺 (pH = 8.0，室温保存)
   

   药品	分子式	分子量	储存浓度	500 ml所需
   三乙醇胺	(HOCH2CH2)3N	149.19	\	66.5 ml
   DEPC处理的去离子水	H2O	18	\	413.5 ml
   浓盐酸	HCl	36.46	12 M	20 ml



5. (预) 杂交缓冲液 (-20°C保存)
   

   药品	分子式	分子量	工作浓度	100 ml所需
   甲酰胺	HCONH2	45.04	50%	50 ml
   柠檬酸钠缓冲液	C6H5O7Na3	258.07	\	25 ml 20×柠檬酸钠缓冲液
   酵母RNA	\	\	250 g/L	500 ml 50 mg/ml酵母RNA
   Denharts溶液	\	\	\	10 ml 50× Denharts溶液
   鲱鱼精子DNA	\	\	500 g/L	5 mg 10 mg/ml鲱鱼精子DNA
   DEPC处理的去离子水	H2O	18	\	9.5 ml



6. DEPC处理的0.5 M乙二胺四乙酸 (EDTA) (pH = 8.0，室温保存)
   

   药品	分子式	分子量	储存浓度	200 ml所需
   乙二胺四乙酸	C10H16N2O8	292.24	\	\
   氢氧化钠	NaOH	40	\	调节pH至8.0

   加入0.1% DEPC，摇匀，避光过夜，灭菌处理。
   


7. DEPC处理的1 M Tris-HCl (pH = 7.4-7.5，室温保存)
   

   药品	分子式	分子量	储存浓度	500 ml所需
   Tris	(HOCH2)3CNH2	121.14	1 M	60.57 g
   浓盐酸	HCl	36.46	\	调节pH至7.4-7.5
   去离子水	H2O	18	\	补足

   加入0.1% DEPC，摇匀，避光过夜，灭菌处理。
   


8. 1 M Tris-HCl (pH = 9.5，室温保存)
   

   药品	分子式	分子量	储存浓度	500 ml所需
   Tris	(HOCH2)3CNH2	121.14	1 M	60.57 g
   氢氧化钠	NaOH	40	\	调节pH至9.5
   去离子水	H2O	18	\	补足



9. 20x 柠檬酸钠 (pH = 7.0，室温保存)
   

   药品	分子式	分子量	储存浓度	500 ml所需
   氯化钠	NaCl	58.44	3 M	87.66 g
   柠檬酸钠	C6H5O7Na3	258.07	0.3 M	38.71 g
   盐酸	HCl	36.46	\	调节pH到7.0
   去离子水	H2O	18	\	补足



10. 1 M 氯化镁 (室温保存)
    

    药品	分子式	分子量	储存浓度	500 ml所需
    六水合氯化镁	MgCl2·6H2O	203. 3	1 M	101.65 g
    去离子水	H2O	18	\	补足



11. 5 M 氯化钠 (室温保存)
    

    药品	分子式	分子量	储存浓度	500 ml所需
    氯化钠	NaCl	58.44	5 M	146.1 g
    去离子水	H2O	18	\	补足



12. PK缓冲液 (现配现用)
    

    药品	分子式	分子量	工作浓度	200 ml所需
    乙二胺四乙酸	C10H16N2O8	292.24	0.005 M	2 ml 0.5 M乙二胺四乙酸
    Tris-HCl	\	157.60	0.05 M	10 ml 1 M Tris-HCl
    蛋白酶	\	\	2 mg/ml	20 ml 20 mg/ml蛋白酶
    DEPC处理的去离子水	H2O	18	\	188 ml



13. 0.1 M三乙胺醇缓冲液 (现配现用)
    

    药品	分子式	分子量	工作浓度	200 ml所需
    三乙醇胺	(HOCH2CH2)3N	149.19	0.1 M	20 ml 1 M三乙胺醇 (pH = 8.0)
    乙酸酐	(CH3CO)2O	102.09	\	500 μl
    DEPC处理的去离子水	H2O	18	\	180 ml



14. 缓冲液B1 (现配现用)
    

    药品	分子式	分子量	工作浓度	200 ml所需
    Tris-HCl	\	\	0.1 M	20 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7.4-7.5)
    氯化钠	NaCl	58.44	0.15 M	6 ml 5 M氯化钠
    去离子水	H2O	18	\	174 ml



15. 缓冲液B2 (现配现用)
    

    药品	分子式	分子量	工作浓度	1 ml所需
    缓冲液B1	\	\	\	900 μl
    绵羊血清	\	\	\	100 μl



16. 缓冲液B3 (现配现用)
    

    药品	分子式	分子量	工作浓度	200 ml所需
    Tris-HCl (pH 9.5)	\	\	0.1 M	20 ml 1 M Tris-HCl (pH 9.5)
    氯化钠	NaCl	58.44	0.1 M	4 ml 5 M氯化钠
    氯化镁	MgCl2	95.21	0.05 M	10 ml 1 M氯化镁
    吐温20	\	1227.5	0.1%	1 ml 20% 吐温20
    去离子水	H2O	18	\	165 ml



17. 缓冲液B4 (现配现用)
    

    药品	分子式	工作浓度	分子量	1 ml所需
    缓冲液B3	\	\	\	1 ml
    四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐	C40H30N10O6C12 /C8H4BrClK2NO4P	\	817.6/402.65	20 ml

致谢

感谢侯永洁指导实验操作。

参考文献

1. Allen Institute for Brain Science. (2011). Technical white paper: in situ hybridization data production.
2. Hou, Y. J., Chen, Y., Wu, J. Y., Du, Y. Y., Zhang, Q. Q., Zhang, T. R. and He, M. (2018). 小鼠脑组织冰冻切片. https://en.bio-protocol.org/p125.
3. SCHAERENWIEMERS N, GERFINMOSER A. A (1993). A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labelled cRNA probes. Histochem 100(6): 431-40.