摘要:原位杂交 (In-situ hybridization, ISH) 可对组织细胞中的RNA进行定性检测。原位杂交的基本原理为:带有标记物的核酸探针通过碱基互补配对特异性结合组织细胞中的待测RNA,形成杂交体。杂交体被抗体识别后,经过显色反应,可直接在组织切片上观察到待测RNA的表达情况。本篇实验指南以地高辛 (DIG) 标记的核酸探针为例,介绍原位杂交的基本操作步骤。
关键词: 原位杂交, 碱基互补配对, 抗原抗体结合, 显色反应
材料与试剂
- 去离子水 (Milipore)
- 经焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理的去离子水
- 4%多聚甲醛 (PFA)
- 经DEPC处理的磷酸盐缓冲溶液 (PBS) (pH 7.4-7.5)
- 20%, 30%蔗糖 (Invitrogen, catalog number: 15503-022) 溶液 (经DEPC处理的1× PBS配制)
- OCT包埋剂 (SAKURA, catalog number: 4583)
- 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) (BBI, catalog number: A600194-0500)
- 盐酸 (HCl) (生工,catalog number: 10011018)
- 三乙胺醇 (TEA) (1M) (VETEC, catalog number: V900257)
- 蛋白酶K (ThermoFisher, catalog number: 25530-049)
- 抗地高辛碱性磷酸酶 (Anti-DIG-AP) (Roche, catalog number: 11093275910)
- RNA探针
- 100%甲醇 (沪试,catalog number: 10014118)
- 封片剂 (碧云天,catalog number: P0126)
- 柠檬酸钠缓冲液 (SSC) (pH 7.0)
- PK缓冲液 (见溶液配方)
- 杂交溶液 (见溶液配方)
- 缓冲液B1 (见溶液配方)
- 缓冲液B2 (见溶液配方)
- 缓冲液B3 (见溶液配方)
- 缓冲液B4 (遮光贮存) (见溶液配方)
仪器设备
- 冰冻切片机 (Leica, catalog number: CM1950) (图1A)
- 防卷板 (Leica, 14047742497)
- 量筒 (申玻)
- 杂交炉 (UVP,catalog number: HL-2000) (图1B)
- 桌面离心机 (Thermo Fisher,catalog number: 75002420) (图1C)
- 金属浴 (奥盛,catalog number: MK2000-2E) (图1D)
- 脱色摇床 (QILINBEIER,catalog number: TS-1) (图1E)
- 磁力搅拌器 (SCILOGEX,catalog number: MS7-H550-Pro)
- 水浴锅 (精宏,catalog number: DK-S24)
- 盖玻片 (Fisherbrand,catalog number: 12-544-E) (图2A) (或:Electron Microscopy Sciences,catalog number: 70329-60;或:LifterSlip,catalog number: 100499-626)
- 载玻片 (Fisherbrand,catalog number: 12-550-15) (图2B)
- 阻水笔 (ImmEdge,catalog number: H-4000) (图2C)
- 杂交盒 (LOCK & LOCK) (内置海绵) (图2D)
- 去离子水盒 (LOCK & LOCK) (内置海绵) (图2E)
- 塑料染色缸 (生工,E678012) (载玻片数量多时可用) 或50 ml离心管 (Thermo Fisher,339652) (载玻片数量少时可用) (图2F, G)
- 培养箱 (精宏,catalog number: SHP-250)
图1. 实验所需仪器. (A) 切片机;(B) 杂交炉;(C) 离心机;(D) 金属浴;(E) 脱色摇床
图2. 实验所需用品. (A) 盖玻片;(B) 载玻片;(C) 阻水笔;(D) 杂交盒;(E) 去离子水盒;(F) 塑料染色缸;(G) 50ml离心管
实验步骤
注:步骤1、2中所有试剂需保证无RNA酶,具体配方见附录,操作时需佩戴口罩、手套,穿好实验服,实验台面使用75%乙醇擦拭,以避免RNA酶污染。
- 原位杂交准备:组织切片
- 原位杂交-第一天:
注:染色缸 (离心管) 需用去离子水清洗后放入60°C烘箱烘干,使用前用DEPC处理的去离子水润洗3次。量筒、盖玻片用前需在180°C烘箱中放置2 h。
- 原位杂交-第二天:
- 原位杂交-第三天:
溶液配方
- DEPC处理的去离子水 (室温保存)
去离子水中加入0.1% DEPC,摇匀,避光过夜,灭菌处理。
- DEPC处理的10× PBS (室温保存)
药品 | 分子式 | 分子量 | 储存浓度 |
| 1 L所需 |
氯化钠 | NaCl | 58.44 | 1.54 M |
| 90 g |
七水合磷酸氢二钠 | Na2HPO4·7H2O | 268.07 | 0.03 M |
| 7.95 g |
磷酸二氢钾 | KH2PO4 | 136.09 | 0.01 M |
| 1.44 g |
加入0.1% DEPC,摇匀,避光过夜,灭菌处理。
- 4% PFA (-20°C保存)
药品 | 分子式 | 分子量 | 工作浓度 | 500 ml所需 |
DEPC处理的10× PBS | \ | \ | 1x | 50 ml |
多聚甲醛 | (HCHO)n | (30.03) × n | 4% | 20 g |
DEPC处理的去离子水 | H2O | 18 | \ | 补足500 ml |
65°C加热,完全溶解后过滤。
- 1 M三乙醇胺 (pH = 8.0,室温保存)
药品 | 分子式 | 分子量 | 储存浓度 | 500 ml所需 |
三乙醇胺 | (HOCH2CH2)3N | 149.19 | \ | 66.5 ml |
DEPC处理的去离子水 | H2O | 18 | \ | 413.5 ml |
浓盐酸 | HCl | 36.46 | 12 M | 20 ml |
- (预) 杂交缓冲液 (-20°C保存)
药品 | 分子式 | 分子量 | 工作浓度 | 100 ml所需 |
甲酰胺 | HCONH2 | 45.04 | 50% | 50 ml |
柠檬酸钠缓冲液 | C6H5O7Na3 | 258.07 | \ | 25 ml 20×柠檬酸钠缓冲液 |
酵母RNA | \ | \ | 250 g/L | 500 ml 50 mg/ml酵母RNA |
Denharts溶液 | \ | \ | \ | 10 ml 50× Denharts溶液 |
鲱鱼精子DNA | \ | \ | 500 g/L | 5 mg 10 mg/ml鲱鱼精子DNA |
DEPC处理的去离子水 | H2O | 18 | \ | 9.5 ml |
- DEPC处理的0.5 M乙二胺四乙酸 (EDTA) (pH = 8.0,室温保存)
药品 | 分子式 | 分子量 | 储存浓度 | 200 ml所需 |
乙二胺四乙酸 | C10H16N2O8 | 292.24 | \ | \ |
氢氧化钠 | NaOH | 40 | \ | 调节pH至8.0 |
加入0.1% DEPC,摇匀,避光过夜,灭菌处理。
- DEPC处理的1 M Tris-HCl (pH = 7.4-7.5,室温保存)
药品 | 分子式 | 分子量 | 储存浓度 | 500 ml所需 |
Tris | (HOCH2)3CNH2 | 121.14 | 1 M | 60.57 g |
浓盐酸 | HCl | 36.46 | \ | 调节pH至7.4-7.5 |
去离子水 | H2O | 18 | \ | 补足 |
加入0.1% DEPC,摇匀,避光过夜,灭菌处理。
- 1 M Tris-HCl (pH = 9.5,室温保存)
药品 | 分子式 | 分子量 | 储存浓度 | 500 ml所需 |
Tris | (HOCH2)3CNH2 | 121.14 | 1 M | 60.57 g |
氢氧化钠 | NaOH | 40 | \ | 调节pH至9.5 |
去离子水 | H2O | 18 | \ | 补足 |
- 20x 柠檬酸钠 (pH = 7.0,室温保存)
药品 | 分子式 | 分子量 | 储存浓度 | 500 ml所需 |
氯化钠 | NaCl | 58.44 | 3 M | 87.66 g |
柠檬酸钠 | C6H5O7Na3 | 258.07 | 0.3 M | 38.71 g |
盐酸 | HCl | 36.46 | \ | 调节pH到7.0 |
去离子水 | H2O | 18 | \ | 补足 |
- 1 M 氯化镁 (室温保存)
药品 | 分子式 | 分子量 | 储存浓度 | 500 ml所需 |
六水合氯化镁 | MgCl2·6H2O | 203. 3 | 1 M | 101.65 g |
去离子水 | H2O | 18 | \ | 补足 |
- 5 M 氯化钠 (室温保存)
药品 | 分子式 | 分子量 | 储存浓度 | 500 ml所需 |
氯化钠 | NaCl | 58.44 | 5 M | 146.1 g |
去离子水 | H2O | 18 | \ | 补足 |
- PK缓冲液 (现配现用)
药品 | 分子式 | 分子量 | 工作浓度 | 200 ml所需 |
乙二胺四乙酸 | C10H16N2O8 | 292.24 | 0.005 M | 2 ml 0.5 M乙二胺四乙酸 |
Tris-HCl | \ | 157.60 | 0.05 M | 10 ml 1 M Tris-HCl |
蛋白酶 | \ | \ | 2 mg/ml | 20 ml 20 mg/ml蛋白酶 |
DEPC处理的去离子水 | H2O | 18 | \ | 188 ml |
- 0.1 M三乙胺醇缓冲液 (现配现用)
药品 | 分子式 | 分子量 | 工作浓度 | 200 ml所需 |
三乙醇胺 | (HOCH2CH2)3N | 149.19 | 0.1 M | 20 ml 1 M三乙胺醇 (pH = 8.0) |
乙酸酐 | (CH3CO)2O | 102.09 | \ | 500 μl |
DEPC处理的去离子水 | H2O | 18 | \ | 180 ml |
- 缓冲液B1 (现配现用)
药品 | 分子式 | 分子量 | 工作浓度 | 200 ml所需 |
Tris-HCl | \ | \ | 0.1 M | 20 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7.4-7.5) |
氯化钠 | NaCl | 58.44 | 0.15 M | 6 ml 5 M氯化钠 |
去离子水 | H2O | 18 | \ | 174 ml |
- 缓冲液B2 (现配现用)
药品 | 分子式 | 分子量 | 工作浓度 | 1 ml所需 |
缓冲液B1 | \ | \ | \ | 900 μl |
绵羊血清 | \ | \ | \ | 100 μl |
- 缓冲液B3 (现配现用)
药品 | 分子式 | 分子量 | 工作浓度 | 200 ml所需 |
Tris-HCl (pH 9.5) | \ | \ | 0.1 M | 20 ml 1 M Tris-HCl (pH 9.5) |
氯化钠 | NaCl | 58.44 | 0.1 M | 4 ml 5 M氯化钠 |
氯化镁 | MgCl2 | 95.21 | 0.05 M | 10 ml 1 M氯化镁 |
吐温20 | \ | 1227.5 | 0.1% | 1 ml 20% 吐温20 |
去离子水 | H2O | 18 | \ | 165 ml |
- 缓冲液B4 (现配现用)
药品 | 分子式 | 工作浓度 | 分子量 | 1 ml所需 |
缓冲液B3 | \ | \ | \ | 1 ml |
四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐 | C40H30N10O6C12 /C8H4BrClK2NO4P | \ | 817.6/402.65 | 20 ml |
致谢
感谢侯永洁指导实验操作。
参考文献
- Allen Institute for Brain Science. (2011). Technical white paper: in situ hybridization data production.
- Hou, Y. J., Chen, Y., Wu, J. Y., Du, Y. Y., Zhang, Q. Q., Zhang, T. R. and He, M. (2018). 小鼠脑组织冰冻切片. https://en.bio-protocol.org/p125.
- SCHAERENWIEMERS N, GERFINMOSER A. A (1993). A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labelled cRNA probes. Histochem 100(6): 431-40.
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