Immunostaining Assay   

材料与试剂

1. 200目筛子 (实验室定制)
   
2. 2 ml离心管
   
3. 载玻片
   
4. 各种型号枪头
   
5. Parafilm
   
6. 水稻种子
   
7. 多聚赖氨酸
   
8. 进口试剂
   1)

   Mannitol
   
   2)

   2-(N-MorpHolino)ethanesμlfonic acid (MES)
   
   3)

   Formaldehyde solution (Sigma, catalog number: F8775-500ML)
   
   4)

   Spermine
   
   5)

   4',6-diamidino-2-pHenylindole (DAPI)
   
   6)

   Mounting Medium for Fluorescence (VECTASHIELD^®, catalog number: H-1000)
   
   7)

   BSA
   
   8)

   CaCl₂
   
   9)

   NaCl
   
   10)

   EDTA
   
   11)

   KCl
   
   12)

   Tris base
   
   13)

   MgCl₂
   
   14)

   Na₂HPO₄
   
   15)

   KH₂PO₄
   
   16)

   TritonX-100
   
   17)

   Tween 20%
   
   18)

   荧光标记二抗：根据本实验室confocal的激光器类型，常用的为Alexa Fluor^® 488 (Invitrogen, catalog number: A-11029)，Alexa Fluor^® 568 (Invitrogen, catalog number: A-11036) 
9. 国产试剂
   1)

   Cellulose “Onzuka R-10” (武汉创新生物技术有限公司，catalog number: BE1203)
   
   2)

   Macerozyme R-10 (武汉创新生物技术有限公司，catalog number: BE0201)
   3)

   Carbenicillin
   
10. 生根培养基 (见生根培养基配方)
    
11. 酶解液 (见溶液配方)
    
12. Tris-HCl Buffer (见溶液配方)
    
13. LOB1 Buffer (见溶液配方)
    
14. Sorting Buffer (见溶液配方)
    
15. 10x KPBS (pH 7.2) (见溶液配方)
    
16. Blocking solution (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 摇床
   
2. 量筒
   
3. 移液枪
   
4. 镊子
   
5. 激光共聚焦显微镜或超高分辨率显微镜
   
6. 真空干燥箱 (Hotpack Vacuum OVEN)
   
7. 恒温箱 (电热恒温隔水式培养箱，黄石恒丰医疗器械有限公司)
   

实验步骤

1. 水稻种子经消毒处理后置于生根培养基 (见生根培养基配方) 上，在暗室培养一周，得黄化苗。
   
2. 取地上部分，将其剪成1 cm大小，于酶解液 (见溶液配方1) 中室温酶解3小时。
   
3. 倒掉酶解液，以蒸馏水冲洗样品3次，于吸水纸上吸掉残留液体。
   
4. 将样品转移至冰上预冷的、含4% (体积/体积) 甲醛的Tris-HCl Buffer (见溶液配方2) 中。真空交联30分钟 (交联步骤可省略)。
   
5. 倒掉含4% (体积/体积) 甲醛的Tris-HCl Buffer，以预冷的Tris-HCl Buffer (不含甲醛) 浸没样品，置于冰上后于摇床上 (50 rpm/min) 洗涤样品2次，10分钟/次。
   
6. 倒掉Tris-HCl Buffer，于吸水纸上吸干样品水分。再将样品转移至LOB1 Buffer (见溶液配方3) 中，用剪刀充分剪碎样品 (约剪5分钟)。
   
7. 将样品经200目筛子过滤两次，收集滤液至2 ml离心管后放置于冰上 (视频1)。
   
   
   
   视频1. 200目筛子过滤样品
   
   
8. 以3倍体积的Sorting Buffer (见溶液配方4) 稀释步骤7中的滤液，即得到含水稻细胞核的样品 (视频2)。
   
   
   
   视频2. 涂片细胞核样品的制备
   
   
9. 取洁净的载玻片，每两张上涂抹20 μl多聚赖氨酸溶液，室温下晾干，约30分钟 (视频3)。
   
   
   
   视频3. 载玻片多聚赖氨酸包被
   
   
10. 将步骤8中的样品点样到载玻片中央(120 μl)，室温下风干至无可流动的液体为止(风干时间不宜太长；到此步骤的样品可于-20 °C下存放3个月，见视频4)。
    
    
    
    视频4. 水稻细胞核涂片
    
    
11. 将载玻片置于染缸中，往其中加入含4% (体积/体积) 甲醛的1x KPBS/0.1% Triton X-100溶液50 ml (KPBS见溶液配方5) 室温下固定样品30分钟 (视频5)。
    
    
    
    视频5. 涂片固定
    
    
12. 以1x KPBS/0.1% Triton X-100(不含甲醛)洗涤载玻片3次，每次50 rpm/min，5分钟/次 (视频6)。
    
    
    
    视频6. 涂片漂洗
    
    
13. 取出载玻片，于吸水纸上吸走残留液体 (载玻片在吸水纸上立一下即可)，往点有样品的部位加入Blocking solution 100-200 μl (见溶液配方6)。剪取适当大小的parafilm，一端向上折一个角后轻轻盖到载玻片上 (注意样品与parafilm间不要有气泡！)。取一干净的空引物盒，内置少许自来水后，将载玻片平放于引物盒上 (保湿)，于37 °C恒温箱中封闭30分钟 (视频7)。
    
    
    
    视频7. 涂片封闭
    
    
14. 用镊子夹住parafilm折角处，轻轻揭掉parafilm (最好先浸没在KPBS中，再揭掉parafilm)，室温下以1x KPBS/0.1% Triton X-100 (不含甲醛) 洗涤载玻片3次，每次50 rpm/min，5分钟/次。
    
15. 取出载玻片，于吸水纸上吸走残留液体 (载玻片在吸水纸上立一下即可)，往点有样品的部位按1:200或1:300 (体积/体积) 加入50 μl-100 μl一抗，剪取适当大小的parafilm，一端向上折一个角后轻轻盖到载玻片上 (注意样品与parafilm间不要有气泡！)。取一干净的引物盒，内置少许自来水后，将载玻片平放于引物盒上(保湿), 4 °C孵育过夜。
    
16. 轻轻揭掉parafilm(同上)，室温下以1x KPBS洗涤载玻片3次，每次50 rpm/min，5分钟/次。
    
17. 再次封闭样品，步骤同“13”。
    注：以下步骤不宜在强光下进行，实验时室内最好关灯，并把窗帘拉上。
    
18. 根据一抗的类型，选择合适激发波长的二抗，以Blocking buffer按1:200的比例稀释二抗。取100 μl加于玻片上，剪取适当大小的parafilm，一端向上折一个角后轻轻盖到载玻片上 (注意样品与parafilm间不要有气泡！)。取一干净的引物盒，内置少许自来水后，将载玻片平放于引物盒上(保湿)，遮光后于37 °C恒温箱中封闭2小时。
    
19. 轻轻揭掉parafilm，室温下以1x KPBS洗涤载玻片3次，每次50 rpm/min，10分钟/次。
    
20. 取出载玻片，于吸水纸上吸走残留液体(载玻片在吸水纸上立一下即可)，往点有样品的部位加入20 μl 2 μg/ml的DAPI，再滴加一滴Mounting Medium for Fluorescence，保湿和减缓荧光淬灭，盖上盖玻片后即可在激光共聚焦显微镜或超高分辨率显微镜下观察。(见图1)
    注：水稻的细胞核较小，建议用激光共聚焦显微镜观察时选用油镜。
    
    
    图1. 免疫染色结果示意图
    

溶液配方

1. 酶解液 (for 10 ml)

   0.6 M Mannitol	1.903 g
   10 mM MES (pH=5.7)	1 ml 100 mM MES
   1.5% Cellulose “Onzuka R-10”	0.15 g
   0.75% Macerozyme R-10	0.075 g
   0.1% BSA	0.01 g
   1 mM CaCl2	0.1 ml 100 mM CaCl2
   0.25 g/ml CN	2 μl

   55 °C溶解后自然冷却至室温
   
2. Tris-HCl Buffer (for 10 ml)

   10 mM Tris-HCl (pH=7.5)	100 μl	1 M Tris-HCl (pH=7.5)
   100 mM NaCl 200 μl	200 μl	5 M NaCl
   10 mM EDTA 200 μl	200 μl	0.5 M EDTA (pH=8.0)

3. LOB1 Buffer (for 10 ml)

   15 mM Tris-HCl (pH=7.5)	150 μl	1 M Tris-HCl (pH=7.5)
   2 mM EDTA	40 μl	0.5 M EDTA
   0.5 mM spermine	10 μl	0.5 M spermine
   80 mM KCl	800 μl	1 M KCl
   20 mM NaCl	40 μl	5 M NaCl
   0.1% Triton X-100	50 μl	20% TritonX-100

4. Sorting Buffer (for 10 ml)

   100 mM Tris-HCl (pH=7.5)	1 ml	1 M Tris-HCl (pH=7.5)
   50 mM KCl	500 μl	1 M KCl
   2 mM MgCl2	20 μl	1 M MgCl2
   0.05% Tween 20%	5 μl	100% Tween
   5% sucrose	0.5 g	Sucrose

5. 10x KPBS (pH 7.2)
   1.28 M NaCl
   20 mM KCl
   80 mM Na₂HPO₄
   20 Mm KH₂PO₄
   
6. Blocking solution
   1% BAS in 1x KPBS/0.1% Triton-X
   
7. 生根培养基

   MSmax stock solution (10x)	50 ml
   MSmin stock solution (100x)	5 ml
   Fe2EDTA stock solution (100x)	10 ml
   Vitamin stock solution (100x)	10 ml
   Sucrose	20 g
   Phytagel	3 g

   加入单蒸水，补水到1,000 ml，使用KOH调节pH值到5.8，121°C灭菌15分钟。