BiFC Assay for Detecting Protein-protein Interaction in Tobacco Leaves   

材料与试剂

1. 注射器
   
2. Nicotiana benthamiana烟草
   
3. 农杆菌 (已转入带目的基因的载体)
   
4. MES (4-morpHolineethanesulfonic acid; Sigma, catalog number: M8250)
   
5. 利福平(rifampicin; Sigma, catalog number: R3501)
   注：利福平用DMSO溶解配制。
   
6. LB培养基
   
7. 乙酰丁香酮
   
8. MgCl₂
9. 0.5 M MES (pH 5.6) (见溶液配方)
   
10. 100 mM乙酰丁香酮 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 激光共聚焦显微镜
   
2. 普通离心机
   

实验步骤

1. 种植Nicotiana benthamiana烟草。在14 h光照/10 h黑暗，温度25 °C，相对湿度70%条件下培养大概4～5周。
   
2. 将含有目地基因的载体转入农杆菌中。
   注：GV3101、EHA105、LBA4404这三种农杆菌均有报道可以用于烟草瞬时转化。在培养农杆菌时候除了添加载体所含有的抗生素外，不同农杆菌还需要添加其它种类抗生素，比如GV3101还需要添加50 μg/ml的利福平。
   
3. 挑取含有目的载体的农杆菌单克隆至含有相应抗生素的5 ml LB培养基中，在28 °C，200 rpm的条件下培养2 d。(新鲜转化的农杆菌单克隆在3 ml培养基培养过夜至 1 d即可)
   
4. 转移1 ml培养的农杆菌菌液至20 ml含有相应抗生素的LB培养基中扩大培养，该LB培养基含15 μM乙酰丁香酮。在28 °C，200 rpm的条件下培养至农杆菌生长的对数期(OD₆₀₀ = 0.5-0.6)。
   
5. 在室温，5,000 rpm离心10 min以收集菌体，用浸染液(含10 mM MgCl₂, 10 mM MES，150 μM乙酰丁香酮，pH = 5.6)悬浮农杆菌菌体至OD₆₀₀ = 1.0。室温静止2～3 h (至少0.5 h，至多不超过3 h。)
   
6. 等体积混合两种含有不同质粒的菌体，用1 ml的针头在烟草叶片背面轻轻点开一个小口 (注意不要刺穿)，再用去掉针头的针管吸取菌液，从叶片伤口处注射到叶片中。用记号笔标记烟草叶片水渍状区域。(见图1)
   
7. 注射过的植株于21 °C左右培养2 d后观察烟草注射农杆菌的区域有无荧光。撕取烟草叶片标记区域 (可以不撕，直接用刀挖出靠近伤口的叶片部分即可) 用激光共聚焦显微镜进行荧光的成像 (叶片背面表皮细胞层较好观察)。(见图1)
   
   
   图1. 农杆菌注射烟草叶片
   

注意事项

1. 选择健康、处于壮年的烟草叶片进行注射，幼嫩或皱缩叶片不易注射，衰老叶片的表达效率较低。叶片气孔打开的时候比较容易注射，因此最好在白天注射。
   
2. 农杆菌菌液浓度是需要自己摸索的一个参数，OD₆₀₀ = 1.0并不一定适用于所有的基因，高浓度可能导致叶片死亡，或者影响定位结果，建议设置不同浓度梯度进行比较，在可以获得荧光信号的前提下尽量采用低浓度的菌液。
   
3. 不同外源基因的瞬时表达效率大不相同——这一点在单转做亚细胞定位的时候表现得特别明显，效率高者基本每次都能达到100%发光，低者可能转10次只能表达出一两次，建议在BiFC之前先做个亚细胞定位评价一下两个基因的表达效率，以便调整两个质粒的转化条件。
   
4. 注射后的植株通常在2 d之后观察，但不同基因表达的时间可能在1-7天不等。
   

溶液配方

1. 0.5 M MES (pH 5.6)
   称取9.75 g 无水MES用去离子水溶解，用NaOH调pH至5.6，定容至100 ml，过滤灭菌后于4 °C保存。
   
2. 100 mM乙酰丁香酮
   称取196.2 mg乙酰丁香酮，用5ml DMSO (二甲基亚砜) 溶解，再加去离子水定容至10 ml，过滤灭菌后于-20 °C保存。