Quantification Analysis of IAA, JA, ABA and SA in Rice   

材料与试剂

1. 1.5 ml离心管
   
2. 移液吸头
   
3. 1 ml注射器 (上海治宇医疗器械有限公司)
   
4. 0.22 μm滤膜 (津腾尼龙66)
   
5. 氮气
   
6. 冰
   
7. 甲醇 (Fisher, HPLC, USA)
   
8. 乙酸 (TEDIA, HPLC, USA)
   
9. NAA (Sigma, USA)
   
10. d5-IAA (Sigma-Aldrich, USA)
    
11. H₂JA (Olomouc, Czech Republic)
12. d6-ABA (Olomouc, Czech Republic)
    
13. 抽提液buffer 1 (见溶液配方)
    
14. 抽提液buffer 2 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 冷冻离心机
   
2. 氮吹仪 (Dry N-EVAPTM111, Organomation Associates Inc. USA)
   
3. 研磨设备
   
4. -70 °C冰箱
   
5. 脱色摇床
   
6. 移液枪
   
7. 通风橱
8. VP-ODS 150L*2.0 column (Shimadzu)
   
9. AB SCIEX Triple Quad^TM 5500 System

实验步骤

1. 田间或温室取样水稻组织0.5 g以上放入液氮中带回实验室，因为每份样3个重复，每个样品抽提激素要约0.1 g鲜重，-70 °C保存直到抽提，尽量不要反复冻融。
   
2. 激素抽提
   2.1

   液氮研磨，尽量磨碎；取约0.1 g于1.5 ml离心管中，加750 μl抽提液buffer 1 (见溶液配方)，颠倒混匀，置冰上，避光 (植物粉末不要加太多，0.1 g足够了，粉末太多抽提不完全)。
   
   2.2

   4 °C、脱色摇床300转/分钟避光抽提16小时以上；4 °C、13,000 rpm离心10分钟，吸上清于一新离心管中。
   
   2.3

   在沉淀中加450 μl抽提buffer 2 (见溶液配方)，4 °C、脱色摇床300转/分钟避光抽提4小时以上，4 °C、13,000 rpm离心10分钟，吸上清，合并两次上清。
   
   2.4

   用1 ml注射器吸取合并的上清过0.22 μm滤膜(津腾公司，尼龙66)，至一新1.5 ml离心管中，在通风橱中用氮气吹干，加200 μl 30%甲醇颠倒混匀后4 °C溶解15分钟。
   2.5

   溶解液在4 °C、13,000 rpm离心15分钟后，轻轻吸取上清150-180 μl至内插管中，放置于质谱专用上样瓶等待上样。
3. 质谱测定
   3.1

   IAA、JA、ABA可直接上样检测。
   
   3.2

   检测SA要稀释50-100倍 (根据质谱上机信号决定)。
   仪器：AB SCIEX Triple Quad^TM 5500 System
   色谱条件：
   Column: VP-ODS 150L*2.0 column (Shimadzu)，P/N228-34937-94
   Mobile phase A: 0.04%乙酸水
   Mobile phase B: 乙腈
   流速：0.25 ml/min
   进样体积：10 μl

   洗脱梯度：	时间	梯度
   	(min)	%A	%B
   	0	95	5
   	3	95	5
   	8	84	16
   	15	0	100
   	18	0	100
   	20	95	5
   	26	95	5

   注：同一样品在不同的色谱条件下出峰时间是不同的，所以没有特定的色谱条件说某一化合物在什么时间出峰没有任何意义。将一般条件下改为具体的色谱条件下各化合物保留时间。完整的色谱条件包括色谱仪型号、色谱柱型号规格、流动相A、B分别是什么溶剂、A、B两项的梯度变化程序、流动相总流速、柱温箱温度，检测器型号等。我们这里用质谱检测就不用写检测器了。
   

结果与分析

1. 在quantitate中点击quantitation wizard (定量向导)，选取要分析的数据文件，根据提示做结果分析。选取中间浓度的标准样品，对各个标准品及内标的谱图进行平滑等积分优化处理，仪器将自动根据标准品的出峰时间和积分参数对未知样品中各对应的峰进行定性和定量分析。
   
2. 点每个样的文件(sample name)，可以查看目前操作的是哪种激素，双击可以查看积分是不是对的。目标化合物在采集过程中因偶然因素出峰时间与标准品保留时间产生较大的偏离时，自动积分会出现峰误判现象，此时需用手动积分重新选取目标化合物的峰进行重新积分，然后更新到结果文件即可；手动积分时，点manual integration mode,选取目标峰进行积分；所以每个文件都必须自己看一下，检查积分是否有问题。
   
3. 在标准曲线文件中sample type中选择standard,在concentration中填写各个标准样品所对应的梯度浓度，点calibration，会出现标准曲线。要求样品中的待测化合物浓度要落在标准曲线的线性范围内：即检测激素的最低和最高浓度都在标准曲线线性范围内；否则都要进行浓缩或者稀释后再定量。
   
4. 曲线做好以后，仪器会根据曲线自动计算出所有未知样品中各个化合物的浓度。先保存结果文件，然后再将结果转化成TXT格式导出，否则其它电脑打不开。导出计算的结果，“file” → “export”，用excel打开，倒数第五列即Calculated Concentration (ng/ml) C就是原始数据。
   
5. 原始数据是检测的浓度，用它乘以体积即200 μl，再除以重量W，
   IAA、JA、ABA激素含量= C * 200/W/1,000 μg/g,
   SA因为稀释了200倍，所以要再乘以稀释的倍数
   

注意事项

1. 抽提液全配成mixture，-20 °C避光可有效保存1-2年。
   
2. 抽提buffer 1和抽提buffer 2使用时，取出后放在冰盒上使用。
   
3. 抽提buffer 2无内标用于洗涤抽提残余内标及样品。
   
4. 抽提buffer 1中有内标，小心操作，如溅到皮肤上应及时清洗。
   
5. 因抽提buffer中含甲醇、乙酸，氮吹仪应在通风橱中使用。
   
6. 因抽提buffer中含低辐射放射性物质，所有直接接触到放射性物质的一次性物品应用塑料袋包装后再丢到垃圾桶中。
   
7. 本实验方法改编自Liu等, 2012。
   

溶液配方

1. 抽提buffer 1 (含内标)
   甲醇:ddH₂O:乙酸=80:19:1(V:V:V)
   内标加入量如下：
   NAA: 作为SA内标，3 ng/μl
   d5-IAA: 作为IAA, IAA-Asp, IAA-Ala内标，10 ng/ml
   H₂JA: 作为JA, OPDA, JA-Ile内标，10 ng/ml
   d6-ABA: 作为ABA内标，10 ng/ml
   
2. 抽提buffer 2 (不含内标)
   甲醇:ddH₂O:乙酸=80:19:1 (V:V:V)
   

参考文献

1. Liu, H., Li, X., Xiao, J. and Wang, S. (2012). A convenient method for simultaneous quantification of multiple phytohormones and metabolites: application in study of rice-bacterium interaction. Plant Methods 8(1): 2.