Detection of Commonly-used Molecular Markers (SSR InDel SNP) in Rice   

材料与试剂

1. PCR试剂
   1)

   10x PCR Buffer (Mg²⁺ Plus) (Takara Bio, catalog number: R10T1)
   
   2)

   rTaq (TaKara Bio, catalog number: R10T1)
   
   3)

   dNTPs Mix (Pharmcia分装)
   
   4)

   ddH₂O
   
   
2. 测序试剂
   1)

   EXOI (New England Biolabs, catalog number: M0293L)
   
   2)

   SAP (Takara Bio, catalog number: D2660A)
   
   3)

   BigDye (ABI, catalog number: 4336913)
   
   4)

   5x Buffer (ABI, catalog number: 4336699)
   
   5)

   甲酰胺(ABI, catalog number: 4311320)
   
   6)

   上样用指示剂 (10x loading buffer) (见溶液配方)
   
   
3. 琼脂糖胶电泳试剂
   1)

   琼脂糖Agarose (G-10, BIOWEST)
   
   2)

   核酸染料GoldView (AMRESCO分装)
   
   3)

   DNA Marker (DL2000 Plus, TransGen, catalog number: BM111)
   
   4)

   0.5x TBE溶液
   
   5)

   5x TBE (见溶液配方)
   
   
4. 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)胶电泳试剂
   1)

   丙烯酰胺 (Acrylamatide, Ultra pure, BIO BASIC INC, catalog number: AB1032)
   
   2)

   甲叉－丙烯酰胺 (Bis-Acrylamatide, Ultra pure, BIO BASIC INC, catalog number: BB0025)
   
   3)

   过硫酸铵AP (Ammonium persulfate, Sigma-Aldrich, catalog number: A3678)
   
   4)

   去离子甲酰胺 (deionized formamid，生工生物, catalog number: F0606)
   
   5)

   NaOH (分析纯，光复)
   
   6)

   溴酚蓝 (Bromophonel blue, Sigma-Aldrich, catalog number: B0126)
   
   7)

   二甲苯氰 (Xylene cyanol FF, Sigma-Aldrich, catalog number: X4126)
   
   8)

   硅化剂 (Plusone Repel-Silane, Amersham. Biosciences, catalog number: 17-1332-01)
   
   9)

   反硅化剂 (Plusone Bind-silane, Amersham. Biosciences, catalog number: 17-1330-01)
   
   10)

   TEMED (Sigma-Aldrich, catalog number: T9281)
   
   11)

   95%乙醇 (分析纯，沪试，国药化试, catalog number: 10009134)
   
   12)

   硝酸银 (分析纯，国药化试, catalog number: 10018461)
   
   13)

   甲醛(分析纯，湖北奥生新材料科技有限公司, catalog number: 83012)
   
   14)

   Tris粉 (Tris Amino，Angus Chemical Company, catalog number: 77-86-1)
   
   15)

   硼酸(分析纯，国药化试, catalog number: 10004818)
   
   16)

   EDTA (分析纯，沪试，国药化试, catalog number: 10009717)
   
   17)

   尿素(分析纯，国药化试, catalog number: 10023218)
   
   18)

   1x TBE溶液
   
   19)

   1.40%的丙烯酰胺胶母液 (见溶液配方)
   
   20)

   过硫酸胺(AP)溶液 (见溶液配方)
   
   21)

   4% PAGE胺胶液 (见溶液配方)

仪器设备

1. PCR仪 (ABI9700)
   
2. 电泳仪 (LIFE TECHNOLOGIES, MODEL 250EX)
   
3. 水平电泳槽 (北京六一)
   
4. 垂直电泳槽 (北京六一)
   
5. 通风橱 (SUNLAB，2004-SFH)
   
6. 凝胶成像系统
   
7. 测序仪 (ABI，3730)
   

实验步骤

1. PCR反应
   1.1

   调整模板浓度至~50 ng/μl。
   
   1.2

   按下列体系配制反应混合液，混匀，加20 μl矿物油，离心5秒。

   Template DNA	2 μl
   10x PCR buffer	2.0 μl
   dNTPs Mix (2 mM)	1.6 μl
   Primer F (10 µM)	0.3 μl
   Primer R (10 µM)	0.3 μl
   rTaq (5 U/μl)	0.1 μl
   Add ddH2O to	20 μl

   1.3

   PCR反应程序：

   94 °C	4 min	1 cycle
   94 °C 30 sec	55 °C 30 sec	72 °C 30 sec 35 cycles
   72 °C	5 min	1 cycle
   25 °C	1 min

   注：以上退火温度可以根据不同引物适当调整。
   
   1.4

   检测：加~2 μl 10x Loading buffer，短暂离心。
   
   
2. 琼脂糖凝胶电泳(适合InDel标记和多态性较大的SSR标记)
   2.1

   将制胶板洗净、晾干，水平放置在工作台上，两端用封条封口，放置梳子，调整好梳子的高度。
   
   2.2

   称取1.2 g琼脂糖于120 ml 0.5x TBE中，用微波炉加热使琼脂糖颗粒完全溶解，取出冷却至50 °C左右时加入5 μl GoldView混匀，倒入制胶板中。
   
   2.3

   凝胶凝固后(~30 min)，小心拔去梳子，取8 μl PCR样品依次点入加样孔中，最后一孔点入5 μl DNA Marker。
   
   2.4

   将制胶板小心放入电泳槽中，打开电泳仪电源，使核酸样品向正极泳动，250 V电泳20-30 min (根据多态性大小调整)。
   
   2.5

   电泳完成后，切断电源，取出凝胶，在清水中短暂漂洗，用保鲜膜包好置于凝胶成像系统中观察照相，读取数据。
   
   
3. PAGE胶电泳(适合一般SSR标记和多态性较小的InDel标记)
   3.1

   胶板的制备

   1)

   将玻璃底板和盖板洗净、晾干。
   

   2)

   在通风橱中用滤纸片沾上95%乙醇擦拭底板和盖板3-5遍至玻璃板洁净无污渍。
   

   3)

   取1 ml 95%乙醇至1.5 ml离心管，加入2 μl反硅化剂，于涡旋震荡器上混匀，均匀倒在用(步骤3.1.2)中95%乙醇擦拭过的玻璃底板上，并用滤纸涂抹均匀。
   

   4)

   取1 ml硅化剂均匀倒在用(步骤3.1.2)中95%乙醇擦拭过的玻璃盖板上，用滤纸涂抹均匀。
   

   5)

   将底板水平放置(涂抹反硅化剂的一面朝上)，在两侧放好压条(spacer)，将盖板(涂抹硅化剂一面朝下)重合在底板上，两侧各用两个夹子夹紧。
   

   6)

   配制胶液：取60 ml 4% PAGE胶液至烧杯中加入500 μl AP液和50 μl TEMED，混匀，将夹好的玻璃底板和盖板倾斜45度，往玻璃底板和盖板之间的缝隙灌胶，待胶液充满整个玻璃板，将玻璃板水平放置，水平插入梳子。胶板制备完后需放置至少1个小时才可使用。 

   
   
   3.2

   电泳
   在水槽中清洗胶板，小心拔出梳子(注意不要弄破胶面)，用水冲去碎胶，垂直放入电泳槽中，两边用3个夹子夹紧，扭紧下部螺丝，加入1x TBE溶液至胶孔覆盖，电泳条件设置；电压：2,000 V，电流：200 mA，功率：90 W，预热40分钟后插入梳子，取3-5 μl PCR产物点样。
   
   3.3

   显影

   1)

   硝酸银溶液配制：称取2 g硝酸银于试剂瓶中，加入2,000 ml蒸馏水溶解完全，倒入塑料盆中，盖上盖子避光保存。
   

   2)

   NaOH溶液配制：称取40 g NaOH于试剂瓶中，加入2,000 ml蒸馏水溶解，加入2瓶盖甲醛溶液，混匀倒入塑料盆中，盖上盖子。
   

   3)

   取下电泳完毕的胶板，分开玻璃底板和盖板，将胶板用蒸馏水漂洗一遍后置入硝酸银溶液中浸泡10分钟，然后取出用蒸馏水漂洗一遍，再放入含甲醛的NaOH溶液中，至带型清晰显出时捞出，用蒸馏水漂洗4-5遍，平放至胶面干燥，进行照相和数据读取。
   
   
4. SNP标记检测
   4.1

   PCR扩增
   参照前面一般PCR扩增。
   
   4.2

   PCR产物检测
   制备琼脂糖胶(1%)，检测PCR扩增产物。特异性扩增带与预期大小相符，亮度(浓度)与Marker (DL 2000，~50 ng/μl)相仿即可。
   
   4.3

   PCR产物消化处理

   PCR产物	5 μl
   10x SAP Buffer	0.3 μl	① 37 °C水浴1 h
   25 mM MgCl2	0.18 μl	② 80 °C水浴20 min灭活
   ExoI(20 U/μl)	0.25 μl	③ 1 Kb左右的片段取3 μl作DNA测序模板
   SAP(2 U/μl)	0.13 μl	注*：取PCR产物尽量避免取到上层矿物油
   Add ddH2O to	8 μl

   4.4

   测序反应

   DNA模板	3 μl	反应程序：
   Primer(单引物)	0.16 μl	96 °C 3 min;
   5x Buffer	1.75 μl	96 °C 10 sec， 50 °C 10 sec， 60 °C 4 min，30~35 Cycles;
   BigDye	0.5 μl	25 °C 10 min
   Add ddH2O to	10 μl

   4.5

   测序产物的纯化

   1)

   1 ml 95%乙醇中加入40 μl 3 M NaAC，混匀后按26 μl/孔分装进测序样品，混匀，放置15 min，3,000 x g离心30 min，弃上清。
   

   2)

   分装75%乙醇，75 μl/孔，3,000 x g离心10 min。
   

   3)

   弃上清，于超净工作台吹干，约5 min。
   

   4)

   分装甲酰胺，7 μl/孔，94 °C变性(~5 min)，置于冰上冷却。 

   
   
   4.6

   上机(ABI3730测序仪)测序
   按测序仪操作说明进行。

注意事项

1. 制备PAGE胶之前，用梳子插入两玻璃板之间，检查玻璃板之间空隙是否均匀；若梳子两侧不能顺利插入，务必调整盖板和底板组合，以免出现制胶厚度不均匀或者是梳子插不进去的情况。
   
2. 使用SSR标记可以先登录网站http://www.gramene.org/查询标记的退火温度和PCR产物大小，选择合适的退火温度和电泳检测条件。
   
3. 同一PAGE胶板进行多道电泳时，应根据PCR产物大小和标记在两亲本之间多态性大小，确定点样顺序和时间间隔。如果标记有拖带现象可以在点样之前将PCR产物进行96°C 3 min 变性。
   
4. 把握好显影时间，小心PAGE胶从玻璃底板上脱落；显影完毕后，尽量在水中漂洗多次，以去除甲醛。
   
   

溶液配方

1. 1.40%的丙烯酰胺胶母液

   丙烯酰胺(Acrylamatide)	380克
   甲叉－丙烯酰胺(Bis- Acrylamatide)	20克

   加60 °C左右的ddH₂O定容至1,000 ml，迅速搅拌至澄清透明。过滤后4 °C保存。
   
2. 过硫酸胺(AP)溶液
   终浓度10%，用分析天平称取4 g AP粉末，加ddH₂O 40 ml，摇匀溶解，4 °C 保存。
   注：不要超过2个星期，最好新鲜配制。
   
3. 上样用指示剂(10x loading buffer)

   甲酰胺(deionized formamid)	500 ml
   4 N NaOH	1.32 ml
   溴酚蓝(Bromophonel blue)	263 mg
   二甲苯氰(Xylene cyanol FF)	263 mg
   ddH2O	25 ml

   混匀后放在摇床上摇12小时，4 °C保存。
   
4. 5x TBE

   Tris粉	54 g
   硼酸(Boric acid)	27.5 g
   0.5M EDTA(PH7.9)	20 ml
   加ddH2O至	1,000 ml

   搅匀后室温保存，0.5和1x TBE溶液用此分别稀释10倍和5倍后用。
   
5. 4% PAGE胺胶液

   配制一板胶
   40%丙烯酰胺胶母液	11 ml
   5x TBE溶液	15 ml
   尿素	36.04 g
   ddH2O	22 ml
   配制40板胶
   40%的丙烯酰胺胶母液	440 ml
   5x TBE溶液	600 ml
   尿素	1,441.6 g
   ddH2O	880 ml

   实际配制时每次配制40板用量，搅拌过夜后过滤，滤液4 °C保存。