摘要:重金属污染矿区环境中的微生物生态研究内容包括鉴别与发现重金属耐受菌属、揭示潜在重金属氧化还原过程、研究重金属污染生物修复策略等,而高效提取污染土壤中的DNA是研究的基础和关键。然而,相比其他土壤生态环境,重金属污染矿区的土壤pH较为极端、重金属浓度高、腐殖质含量高、缺乏碳源氮源等营养物质,因此该类环境中生物量较低且含有大量影响DNA提取的抑制因子,从而导致直接使用商业 DNA 提取试剂盒的提取效率低且 DNA 质量较差。本方法对此进行了改进,利用去腐试剂 (主要成分为EDTA、NaCl等) 对污染矿区土壤样品进行前处理以去除腐殖质与重金属,并加入OptiprepTM细菌分离液通过密度梯度离心对土壤样品中的微生物进行分离,之后使用PowerSoil ® Pro提取试剂盒 (试剂盒A) 的标准方法进行DNA的提取。改进后的方法明显提高了DNA的质量,更利于后续的PCR扩增等实验。
关键词: 重金属污染, 矿区土壤, DNA提取
材料与试剂
- 1 ml、5 ml枪尖、10 ml移液管
注:为减小剪切力对核酸的损伤,可将枪尖头部稍剪一下
- 50 ml聚四氟乙烯无菌高速离心管 (Nalgene,catalog number: 3114-0050)
- 50 ml无菌注射器
- 细菌分离液 (OptiPrepTM,LOT#00119,4-30 °C避光保存)
- DNA提取试剂盒A:品牌QIAGEN, PowerSoil® Pro Kit, catalog number: 47014-100,15-25 °C保存 (其中CD2保存于4 °C);试剂盒提供的溶液与材料包括:CD1、CD2、CD3、EA、CD5、CD6,BowerBead Pro离心管,2 ml 无菌离心管、1.5 ml 洗脱管、MB Spain过滤柱
- DNA提取试剂盒B:品牌QIAGEN, PowerSoil® DNA Isolation Kit强力土壤DNA提取试剂盒,catalog number: 12988-10;试剂盒提供的溶液与材料包括:PowerBead Solution,C1、C2、C3、C4、C5,2ml、50 ml无菌离心管,DeNase Purmax过滤柱
- 去离子水
- 1 M Tris-HCl缓冲液:Solarbio,catalog number: T1150,pH 8.0,常温保存
- 0.22 µm滤膜 (Millipore, GSW04700)
- 磷酸二氢钠二水合物:阿拉丁,S102315-250g
- 磷酸氢二钠,无水:阿拉丁,S118443-250g
- 氯化钠:阿拉丁,C111535-500g
- DL15000 DNA Marker:TaKaRa,LOT#AK90932A,-20 °C保存
- 焦磷酸盐:MACKLIN,S817837-500g (见溶液配方)
- 吐温20:CAS [9005-69-5],密封保存 (见溶液配方)
- 去腐蚀剂S0 (见溶剂配方)
- 3 M乙酸钠 (见溶剂配方)
- 70% 乙醇 (见溶剂配方)
仪器设备
- 1 ml、5 ml、10 ml移液枪
- 高速离心机 (均可至4 °C低温) :
- 涡旋仪:品牌Scientific Industries,model: Vortex Genie-2
- 涡旋仪水平50 ml离心管支架:model: SI-H506
- 电子天平:品牌HANGPING,model: JA2003N
- 超净工作台:苏净安泰,model: YJ-1340
- 纯水仪:美国Milli-Q型
- 电热鼓风干燥箱:天津市泰斯特仪器有限公司,model: WGLL-230BE
- 高压蒸汽灭菌器:品牌PHCBI,model: MLS-3781L-PC
- 循环水式多用真空泵:郑州恒岩仪器有限公司,model: SHB-IIIS
- 过滤器:品牌Nalgene,catalog number: 300-4050
- 琼脂糖凝胶电泳仪:北京市六一仪器厂,model: DYY-6C
- 超微量紫外分光光度计:品牌Thermo Scientific,model: NANODROP 1000
- 真空离心浓缩仪:品牌Eppendorf,model: Concentrator plus
实验步骤
- DNA提取准备工作 (Fang et al, 2015):
- 样品前处理:
- 细胞分离与富集 (见视频操作) (Pascaud et al, 2012; Neveu et al, 2014):
- 使用DNA提取试剂盒A提取DNA:
- 使用DNA提取试剂盒B提取DNA (对照组):
按照PowerSoil® DNA Isolation Kit强力土壤DNA提取试剂盒的标准方法进行DNA提取,提取方法本文不做详细叙述。提取得到的DNA样品按下列步骤进行浓缩:
结果与分析
图3. 两种方法提取得到的DNA电泳结果对比图A:使用本文叙述方法;B:使用试剂盒B方法;E:大肠杆菌E. coli DNA对照;N:A方法的阴性对照 (将样品放入500°C马弗炉内烘烤4 h)
图 4. 使用Nanodrop对两种方法提取得到的DNA样品质量测试结果Sample A:使用本文叙述方法;Sample B:使用试剂盒B方法
表1. 使用Nanodrop对两种方法提取得到的DNA样品浓度与质量测试结果
注意事项
- 所有操作步骤均推荐在超净工作台内进行,实验所用剪刀均需提前浸泡于75%的酒精内,所用离心管与枪尖均需提前进行高温蒸汽灭菌 (121 °C,30 min),避免对样本微生物造成污染。
- 当同时使用涡旋仪震荡的离心管数目过多时,可增加5 ~ 10 min的涡旋时间,以保证所有离心管能够充分震荡混合。
- 加入细菌分离液时应将枪尖小心地伸入离心管的底部,且在加入时缓慢上移枪尖,防止样品撒出;加入细菌分离液之后应避免震荡离心管。
- 使用转速14,000 × g进行离心前离心管应严格配平 (离心管之间质量差< 0.01 g),需使用50 ml聚四氟乙烯离心管或可承受超速离心的无菌离心管,降低超速离心对离心机的损害,且避免离心管的破裂。
溶液配方
- PBS缓冲液
按上表称取试剂,加入200 ml的去离子水,搅拌溶解,加入NaOH或者HCl调节pH到7.4,然后定容至1 L,高压蒸汽灭菌灭菌,常温保存。
- 1% (wt/v) 的焦磷酸盐 (试剂S1)
称取1 g焦磷酸盐固体用PBS定容至100 ml使用0.22 µm滤膜过滤灭菌,常温保存。
- 5% (v/v) 的吐温20 (试剂S2)
量取5 ml吐温20溶液用PBS定容至100 ml,高压蒸汽灭菌,常温密封保存。
- 去腐试剂S0
1) 配置1 M NaH2PO4:称取1.56 g NaH2PO4·2H2O固体加入10 ml去离子水内,搅拌溶解。
2) 配置1 M Na2HPO4:称取23.20 g Na2HPO4·5H2O固体加入100 ml去离子水内,搅拌溶解。
3) 混合6.8 ml NaH2PO4与93.2 ml Na2HPO4,使用NaOH调节pH至8.0。
4) 配置0.5 M EDTA:称取37.44 g EDTA固体加入200 ml去离子水内,调节pH至8.0使其溶解。
5) 配置5 M NaCl:称取87.66 g NaCl固体加入300 ml去离子水内,搅拌溶解。
6) 混合3)、4)、5) 与100 ml Tris-HCl,加入去离子水定容至1 L。
7) 所得混合溶液即为去腐试剂S0,将S0高温蒸汽灭菌,常温保存。
- 3 M乙酸钠
称取 40.8 g 的三水合乙酸钠,用去离子水定容至100 ml,搅拌待其完全溶解后,加入HCl 将pH调整至5.2,高压蒸汽灭菌,置于阴凉处室温保存。
- 70%乙醇
将无水乙醇与去离子水按7:3 (v/v) 混合,置于4 °C冰箱内保存。
致谢
感谢国家自然科学基金项目“微生物—粘土矿物—重金属铀与铬相互作用过程”与教育部—中国地质大学 (北京) 求真研究群体“极端环境生物地球化学群体”对本研究方法的资助。
参考文献
- 窦敏娜. (2018). 重金属污染环境土壤细菌总DNA提取方法探索. 陕西农业科学 64(05): 37-38, 52.
- Fang, Y., Xu, M. Y., Chen, X. J., Sun, G. P., Guo, J., Wu, W. M. and Liu, X. D. (2015). Modified pretreatment method for total microbial DNA extraction from contaminated river sediment. Front Env Sci Eng 9: 444-452.
- Pascaud, A., Soulas, M. L., Amellal, S. and Soulas, G. (2012). An integrated analytical approach for assessing the biological status of the soil microbial community. Eur J Soil Biol 49: 98-106.
- Neveu, M., Poret-Peterson, A. T., Lee, Z. M. P., Anbar, A. D. and Elser, J. J. (2014). Prokaryotic cells separated from sediments are suitable for elemental composition analysis. Limnol Oceanogr: methods 12(7): 519-529.
Please login or register for free to view full text
View full text
Download PDF
Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:郭东毅, 陈泓羽, 李方如, 占迪, 董海良. (2021). 一种针对重金属污染土壤的高效DNA提取方法:去腐试剂前处理结合标准试剂盒提取. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003707. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003707.
How to cite: Guo, D. Y., Chen, H. Y., Li, F. R., Zhang, D. and Dong, H. L. (2021). An Efficient DNA Extraction Method for Soil with Heavy-metal Contaminations: Humus Removal Reagents for Sample Pre-treatment Combined with DNA Standard Kit. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003707. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003707.