Determination of Gas and Methane Production in In vitro Ruminal Fermentation   

材料与试剂

1. 60 ml注射器（龙康鑫医疗器械有限公司）
2. 气体采样袋（德霖气体包装有限公司）
3. 5 ml进样针（安捷伦科技有限公司）

仪器设备

1. 发酵瓶（南京金正教学仪器有限公司，规格：180 ml）
2. 恒温培养箱（宾德环境试验设备有限公司，BF115）
3. 气压转换器（上海瑞望仪器设备有限公司，ANKOM RFS）
4. 气相色谱（安捷伦科技有限公司，7890B）
5. 氮气气瓶（南京特种气体股份有限公司）
6. 混合空气气瓶（南京特种气体股份有限公司）

实验步骤

1. 实验背景

1. 体外发酵可以模拟瘤胃饲料发酵动力学过程，评价瘤胃微生物对不同饲料的降解效果。其中，产气量是体外发酵中评价饲料营养成分的重要指标。本实验方案适用于厌氧发酵，在添加培养基的厌氧密闭发酵瓶中接种瘤胃微生物以及发酵底物，随后将发酵瓶放入39 °C恒温培养箱中模拟瘤胃环境进行发酵。瘤胃微生物在降解底物的过程中产气，在发酵过程中检测发酵瓶中的产气量并分析气体成分，可以从产气角度评价瘤胃发酵效果。压力传感器广泛应用于瘤胃体外发酵中的产气检测过程，该仪器能检测到环境中的压力变化。当发酵瓶内产气时其内部压力高于外界环境压力，外接注射器筒可以平衡瓶内气压，通过记录流入到注射器筒中的气体体积，从而确定相应的产气体积。

2. 产气量的检测

1. 测定产气量前，对试验操作桌面和压力传感器连接的针头用75%的酒精进行消毒。
2. 将已经接种瘤胃微生物以及发酵底物的厌氧密闭发酵瓶从39 °C非厌氧恒温培养箱中取出，测定时用75%的酒精消毒发酵瓶顶部的橡胶塞。先观察压力传感器上显示的环境压力，将压力传感器上的针头与注射器上的针头同时插入橡胶塞，此时压力传感器显示的气压值因为感受到的压力变化而升高。使用注射器抽取发酵瓶内的气体，当气压值恢复至初始值（即环境压力）时，读取注射器刻度，流入注射器中的气体体积即为发酵产气量 (Haitjema et al.,2014)。随后将压力传感器上的针头与注射器上的针头同时拔出橡胶塞。
3. 将注射器内的气体打入气体采样袋中以便后续测定甲烷的含量，将测定完成的发酵瓶放回39 °C恒温培养箱中。
4. 将每个时间间隔测定得到的气体体积累计相加，即可得到体外发酵过程中的总产气量。
5. 注意事项：同时从恒温培养箱中取出不多于三瓶发酵瓶；每个发酵瓶测定时间应少于15 s。
   
   
   图1. 压力传感器使用示意图
   
   

3. 甲烷产量检测
   

1. 依次打开与气相色谱连接的氮气与混合空气气瓶，打开气相色谱开关。
2. 打开电脑，选择气相色谱联机程序 （OpenLab CDS，下载地址：https://www.agilent.com/zh-cn/product/software-informatics/analytical-software-suite/chromatography-data-systems/openlab-cds）。
3. 设定“甲烷二氧化碳程序” ，具体参数设置见下表 (胡伟莲等, 2006)：
   
   

   进样口	加热器：250 °C
   	压力：10 psi
   	总流量：15 ml/min
   	隔垫吹扫流量：3 ml/min
   	分流比：5:1
   	分流流量：10 ml/min
   色谱柱	Aglient porapak Q G3591-80135:1
   柱箱	柱箱温度：80 °C
   	平衡时间：0.5 min
   	最高柱箱温度：250 °C
   	运行时间：7.5 min
   TCD检测器	加热器：200 °C
   	参比流量：45 ml/min
   出峰时间	氢气：2 min
   	二氧化碳：2.5 min

   
   
4. 等待程序就绪后测定样品，用进样针抽取气袋中收集到的气体（1 ml），将气体打入进样口，与此同时按下气相色谱上的开始按键。
5. 单个程序运行结束，在脱机程序中查看检测报告。
6. 依次进样测定直到全部样品测定结束，测定结束后点击关机程序，直到关机程序就绪，关闭气相色谱。
7. 依次关闭与气相色谱连接的混合空气与氮气气瓶。
8. 关闭联机与脱机程序，关闭电脑。
   

致谢

感谢国家自然科学基金委（31772627）的支持。
感谢加州大学Haitjema等以及浙江大学胡伟莲等所做的研究工作，感谢南京农业大学消化道微生物研究室的其他师生，以上均对本实验方案的完成提供了很大的帮助。

参考文献

1. Haitjema, C.H., Solomon, K.V., Henske, J.K., Theodorou, M.K. and O'Malley, M.A. (2014), Anaerobic gut fungi: Advances in isolation, culture, and cellulolytic enzyme discovery for biofuel production. Biotechnol. Bioeng 111: 1471-1482.
2. 胡伟莲，王佳堃，吕建敏，郭嫣秋，刘建新. (2006) 瘤胃体外发酵产物中的甲烷和有机酸含量的快速测定. 浙江大学学报, 02: 217-221.