摘要:本实验建立了从海洋沉积物中分离和收集细胞的方法。主要利用EDTA,吐温80,焦磷酸钠和甲醇作为分离洗脱剂,结合间歇超声处理和Nycodenz密度梯度离心,有效地将细胞从沉积物颗粒上洗脱分离出来,同时减少细胞在洗脱分离过程中的破碎率。此方法适用于海洋沉积物样品中细胞的提取,再通过 0.22 μm滤膜收集细胞,SYBR Green I 染色,最后在荧光显微镜下对细胞进行观测和计数。
关键词: 海洋沉积物, 细胞提取, 细胞染色, 细胞计数, 荧光显微镜
材料与试剂
- 离心管 (2ml, Axygen, USA, catalog number: MCT-200-C)
- 0.22 μm聚碳酸纤维膜 (GTBP) (Millipore, Billerica, MA, USA, catalog number: GTBP02500)
- 滤膜衬垫纸 (Whatman, Grade GF/C:1.2µm, catalog number: 1822-055)
- 0.22 μm针式过滤器 (Millipore, Millex-GP, catalog number: SLGPR33RB)
- 多聚甲醛 (上海泰坦科技有限公司,catalog number: 410730010)
- NaCl (国药集团化学试剂有限公司,catalog number: S9625-500G)
- 10x磷酸缓冲盐溶液 (10x PBS溶液,pH =7.4,Sigma, catalog number: P5368)
- 乙酸钠 (Sigma, catalog number: S5636)
- 乙酸 (Sigma, catalog number: A6283)
- Nycodenz (Axis-Shield, catalog number: 1002424)
- SYBR Green I 核酸染料10,000× 浓缩液 (InvitrogenTM, catalog number: S7563)
- 甘油 (国药集团化学试剂有限公司,catalog number: G7757-500ML)
- 甲醇 (国药集团化学试剂有限公司,catalog number: 179957-1L)
- 0.5 M乙二胺四乙酸二钠溶液 (北京索莱宝科技有限公司,catalog number: E1170)
- 十水焦磷酸钠 (国药集团化学试剂有限公司,catalog number: 205975000)
- 吐温80 (国药集团化学试剂有限公司,catalog number: 278632500)
- 肖特瓶 (100ml,Schott,catalog number:21801245)
- 聚醚砜布氏漏斗 (25 mm,50 ml,PALL,catalog number: 4204)
- 橡胶塞 (直径适配抽滤瓶,成阳公司,catalog number: 10025574028902)
- 抽滤瓶 (GG-17,蜀牛玻璃抽滤瓶500 ml,catalog number: 45264074266)
- 耐高温磁性搅拌子
- 沉积物细胞固定液 (见溶液配方)
- 醋酸缓冲液 (pH = 4.6) (见溶液配方)
- 含3% NaCl的磷酸缓冲盐溶液 (见溶液配方)
- 1x磷酸盐缓冲液 (见溶液配方)
- 去污剂混合液 (见溶液配方)
- Nycodenz密度梯度溶液 (见溶液配方)
- 100x SYBR Green I染液 (见溶液配方)
- 50%甘油 (见溶液配方)
仪器设备
- 离心机 (Eppendorf 5430,德国,Eppendorf)
- 涡旋仪 (Vortex Genie® 2 Vortex,美国,MO BIO)
- 移液枪 (10 μl, 200 μl, 1 ml,德国,Eppendorf)
- 高压灭菌锅 (G154DWS,中国,致微仪器有限公司)
- Nikon ECLIPSE 90i全自动科研级显微镜 (ECLIPSE 90i,日本,Nikon)
- 荧光滤光块(FITC, Texas Red, 具体参数详见备注,日本,Nikon)
- 真空泵 (津腾GM-0.5B,中国,津腾公司)
- 超声波破碎仪 (Thermofisher, FB50220,美国,Thermofisher)
- 电磁加热搅拌器 (TH-500,中国,上海沪西分析仪器厂)
荧光滤光块备注:
实验基本原理
海洋沉积物中含有大量的矿物和有机质颗粒,而微生物会附着在这些颗粒物的表面或者被这些颗粒物包裹。这会阻碍我们对沉积物中微生物多样性和生态功能的研究。本方法主要利用化学试剂溶解颗粒物,并结合超声破碎和密度梯度离心使细胞和颗粒物分离,最后收集细胞。基本原理如下:
- 甲醛溶液固定细胞:甲醛可以迅速与细胞中氨基酸结合,并逐渐使蛋白质交联,致使细胞失活且内容物被包裹在交联的蛋白质网络内,起到固定细胞的作用。
- 化学试剂剥离细胞:沉积物颗粒物中含有大量的碳酸盐和矿物质,化学法是利用乙酸溶解碳酸盐使附着在碳酸盐颗粒上的细胞脱离、加入甲醇和去污剂溶液 (吐温和焦磷酸) 有助于有机质 (蛋白质) 颗粒的解聚和溶解、EDTA可以螯和金属离子,改变矿物对细胞的吸附。
- 超声剥离细胞:利用物质性质的差异,细胞与颗粒物在超声处理下震动频率不同,细胞与颗粒物的结合得以松散开来。
- 密度梯度离心:可以利用不同浓度的Nycodenz溶液配制成密度梯度,通过离心,使得不同密度的细胞分布在不同的密度梯度中,大颗粒沉降到管底。同时,由于颗粒物在沉降过程中会在其后端引发湍流并拖拽附近细胞沉降,而越低的雷诺数越不易引发湍流。溶液粘度越高,雷诺数越低。因此,通过逐步提高溶液密度与粘度,离心管内湍流的形成会被显著抑制,最终将大部分细胞保留于密度梯度溶液中。
- 荧光染色:荧光染色是通过SYBR Green I染液,是一种能够结合双链DNA双螺旋小沟区域的发射峰位于绿光区域的染料。在游离状态下,SYBR Green I发出微弱的荧光,但是与双链DNA结合后,荧光强度大大增强。可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。
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图 1. 海洋沉积物中微生物细胞荧光染色图片
实验步骤
一、实验器材灭菌
- 滤膜衬垫纸放入超净台,打开紫外灯杀菌30 min。布氏漏斗,胶塞和抽滤瓶121 °C高压灭菌20 min,然后烘干使用。
- 需有阴性对照确保各环节试剂无污染。用与样品等体积的无菌水作为对照,所有步骤与样品处理步骤相同,最后荧光显微镜观察,并细胞计数。确保在随机挑选的16个视野中没有染色的微生物细胞。
二、样品处理
- 取一定体积的沉积物样品,用沉积物细胞固定液,以1:5 (体积比例,样品1体积,固定液5体积) 的比例稀释并固定样品,用涡旋仪 (Vortex) 混匀;4 °C保存20 min,然后取100 μl固定样品,装入2 ml离心管进行细胞提取 (可以多做几个平行样品)。
- 在超净台中,向100 μl的稀释样品中加入500 μl醋酸缓冲液 (pH = 4.6),盖上管盖,放在室温下反应两小时,每半小时开一次管盖,以排出CO2。
- 3,000 × g离心10 min,离心结束后,将上清转移到干净的2 ml离心管中,收集待测(视频1)。
Video 1. 转移细胞悬液
- 上述步骤离心后的沉淀即为除碳酸盐后的沉积物,向该沉淀中加入400 μl 含有3.5% (w/v) NaCl的PBS溶液,重新悬浮沉淀,并加入50 μl的去污剂混合液和50 μl的甲醇,轻柔混匀溶液,室温反应3-5 min。
- 用注射器在样品悬液底部分别依次缓慢加入500 μl 30%、50%和80% (w/v) Nycodenz溶液 (视频2)。
Video 2. 制备密度梯度Nycodenz溶液
- 3,000 × g离心10 min,从表面吸取上清溶液,避免吸取到沉淀,将所有上清溶液转移至干净的离心管内,收集待测。
注:不要跟第3步的上清液放在一个管内,否则EDTA会和Ca离子螯合,产生沉淀。 - 用400 μl 3.5% NaCl的PBS溶液将管内沉淀重悬,并加入去污剂混合液和甲醇各50 μl。
- 将步骤7中装有沉淀混合溶液的2ml离心管置于冰水混合物上,超声波探头插入冰水下3 cm并距离离心管5 cm,15 W超声,每次10 s,间隔20 s,一共5次 (超声波探头放置位置见视频3)。
Video 3. 超声法解离细胞颗粒物聚合体
- 重复第5-6两步 (加Nycodenz,离心,取上清),将上清液装入无菌离心管中,收集待测。
- 将上述获得的三部分上清液过滤到0.22 μm滤膜上:先用无菌水润洗漏斗两次,垫上滤膜衬垫纸,用无菌水润湿,启动真空泵将纸垫吸附在漏斗上,垫上滤膜,滤膜边缘要与滤器口对齐,拧紧漏斗,加入5 ml 3.5% NaCl的1x PBS溶液,静置2-3 min检测是否漏液。如果不漏液的话,再加入上清液,缓慢吹打几次、搅匀后再启动真空泵抽滤,以保证所有细胞在膜上分布均匀。若漏液,重新组装各部分并再次检验是否漏液。
- 在超净台内,将滤膜放置在无菌培养皿上,用移液器吸取100 μl 100x SYBR Green I染液均匀滴加在滤膜上,避光染色30 min后,用无菌滤纸,放在滤膜边缘吸干多余的染液。
- 加入40 μl 50%的甘油作为防淬灭剂和折光介质覆盖在滤膜上,压上盖玻片,除去气泡,用荧光显微镜检测。
- 开启荧光显微镜,将载玻片放在显微镜的载物台上固定,10倍镜粗调焦距,40倍镜下细调焦距,在明场下观察滤膜至能清晰分辨滤膜表面的纹理,表明 此时焦平面已调节至滤膜表面附近,找到目标视野,在盖玻片上滴少量镜油,再放入载物台上,转换成油镜,并切换显微镜至荧光观察模式,选择荧光通 道FITC滤光块。样品中微生物细胞应呈明亮绿色荧光,且形态符合微生物细胞形状。沉积物中部分杂质也会吸附荧光分子并呈现类似荧光信号,可以转换荧光信号到Tex red荧光通道,如果颗粒仍旧有红光,有可能是沉积物颗粒,而非细胞,应小心分辨。
- 观察并拍照,保存合适的图片用于细胞计数。
- 观察和拍照结束后,关闭所有电源,用二甲苯擦拭油镜物镜端镜头,将载物台调整至原始位置,换镜转盘转换到空镜头位。
- 细胞计数:对于每个滤膜,随机挑选16个目镜视野,拍照后统计视野中微生物总 数a。每个样品应有数个平行组过滤在相应数量b的滤膜上。为使结果可信,应满足
> 1000 (个)。 - 估算每张滤膜上的微生物总数
。其中,m为视野面积,a为该滤膜上16个视野中微生物总数,d为漏斗接触滤膜处内径。估算原始样品中微生物数量x = c/bV,其中,V为计算得到的过滤至单一滤膜上的原始样品体积,b为平行组数量。
溶液配方
- 沉积物细胞固定液 (4% (w/v) 多聚甲醛溶液)
在通风橱内称取 4 g多聚甲醛,0.1 g氢氧化钠,以及2 g氯化钠,加入到90 ml 1x PBS缓冲液中,放入磁力搅拌子,在磁力搅拌器上溶解。待白色颗粒完全溶解后,用1 M 盐酸溶液调节pH为7.0左右并补充1x PBS至100 ml,然后用0.22 μm无菌的针式过滤器过滤到无菌玻璃瓶内,4 °C保存。
- 1x磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer saline,PBS)
取100 ml 10x磷酸盐缓冲液 (pH = 7.4),加入到800 ml无菌去离子水中,反复颠倒几次混匀,用无菌去离子水定容至1000 ml,121 °C高压灭菌20 min,冷却至室温待用。
- 含有3.5% NaCl的PBS溶液
称取3.5 g NaCl,加入到100 ml 1x PBS溶液中混匀,121 °C高压灭菌20 min,冷却至室温待用。
- 醋酸缓冲液(pH = 4.6)
量取2 ml乙酸,称取3.5 g 醋酸钠和3.3 g NaCl,加入到80 ml去离子水中,再加入5 ml 40%甲醛溶液混合均匀,定容至100 ml,用稀盐酸调节溶液pH = 4.6,用0.1 μm无菌滤膜过滤至无菌的玻璃瓶中,室温保存。
- 去污剂混合液
量取0.5 M 乙二胺四乙酸钠溶液 (Ethylene Diamine Tetra acetic Acid,EDTA,pH 8.0) 2 ml,称取焦磷酸钠 0.266 g加入到EDTA中,再吸取0.1 ml 吐温-80 (Tween 80) 加入到溶液中,补充去离子水至10 ml。用0.22 μm无菌针式过滤器过滤至无菌的玻璃瓶中,避光室温保存。
- 梯度密度Nycodenz溶液
称取30 g,50 g和80 g Nycodenz粉末,分别加入到80 ml去离子水中,并用去离子水定容至100 ml,配制成质量体积分数分别为30%、50%和80% (w/v) 的Nycodenz 水溶液。然后使用无菌的针式过滤器过滤灭菌,并收集在避光的无菌离心管中,4 °C保存。
- 100x SYBR Green I染液
避光环境下,在超净台中用移液器吸取10 μl SYBR Green I 10,000x原液,加入到装有990 μl无菌去离子水的2 ml离心管中,离心管外壁包上铝箔避光,在vortex上混匀1 min,4 °C保存。
- 50%甘油
量取50 ml甘油,加入50 ml去离子水,用0.2 μm无菌滤膜过滤,保存至无菌的玻璃瓶中,室温保存。
致谢
本实验方案摘自Jens Kallmeyer和Yuki Morono等人发表的文章New cell extraction procedure applied to deep subsurface sediments: Cell extraction of deep subsurface sediments和An improved cell separation technique for marine subsurface sediments: applications for high-throughput analysis using flow cytometry and cell sorting。
参考文献
- Kallmeyer, J., Smith, D. C., Spivack, A. J. and D'Hondt, S. (2008). New cell extraction procedure applied to deep subsurface sediments: Cell extraction of deep subsurface sediments. Limnol Oceanogr Meth 6: 236-245.
- Morono, Y., Terada, T., Kallmeyer, J. and Inagaki, F. (2013). An improved cell separation technique for marine subsurface sediments: applications for high‐throughput analysis using flow cytometry and cell sorting. Environ microbiol, 15(10): 2841-2849.
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Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:牛明杨, 贾泽宇, 王风平. (2021). 海洋沉积物样品细胞提取及荧光显微镜计数法. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003376. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003376.
How to cite: Niu, M. Y., Jia, Z. Y. and Wang, F. P. (2021). Cell Extraction of Sediment Samples and Fluorescence Microscope Counting Method. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003376. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003376.