The Binding Affinity Analysis of Protein Ligand Interacting with Receptor by Alto LSPR    

材料与试剂

1. 羧基芯片卡盒（Nicoya，KIN-CART-CBX-16）
2. 羧基芯片实验试剂组合套装（Nicoya，ALTO-R-CBX-OPT）
3. 10× PBS（Cytiva，catalog number: 28995084）
4. PBST 缓冲液成分（见溶液配方）
   

仪器设备

1. 全自动高通量分子相互作用分析仪Alto（Nicoya，ALTO16）
2. 仪器控制和数据分析软件（Nicoya，ALTO-NICO-LM）
3. 数据处理工作站（成就3910）

Alto LSPR 仪器及原理

 一、仪器组成及原理

1. 仪器组成
   仪器包括一个显示触摸屏，用于通过用户界面访问仪器。该仪器承载一个芯片卡盒进行SPR实验，该卡盒可以插入仪器的卡盒装载舱中进行分析测试。
2. 基本原理
   Alto将LSPR传感器集成到数字微流控（DMF）卡盒中，创建了16个独立检测通道。其原理和特点如下：
   LSPR是指当光线入射到由贵金属构成的纳米颗粒上时，如果入射光子频率与贵金属纳米颗粒或金属传导电子的整体振动频率相匹配时，纳米颗粒或金属会对光子能量产生很强的吸收作用，就会发生局域表面等离子体共振的现象，这时会在光谱上出现一个强的共振吸收峰，当有配体结合或分析物结合时，吸光度位置波长发生微小变化，其原理如图1所示（图源 https://nicoyalife.com/resources/what-is-spr/lspr-vs-spr-2/）。
   
   
   图1 LSPR基本原理
   
   DMF是一种通过电压精准控制和操纵电极上的离散纳米液滴移动的液体驱动技术。通过使用与标准孔板形状兼容的低成本、一次性卡盒，不需要任何物理泵、阀门或管道，解决了传统SPR流路系统带来的相关问题，同时提高了对复杂样本（如血清，细胞裂解液上清，大的病毒颗粒等）的兼容性。DMF卓越的液体处理能力能精准控制最小350 nL液滴，通过软件控制可以实现精确的全自动样品浓度梯度稀释，仅需2 μL样品即可获得一组完整的动力学和亲和力数据，比传统SPR样本体积低500倍。
   Alto是世界上第一个实现LSPR与DMF技术整合的桌面型SPR系统，相比于传统SPR大大减少了实验步骤，如图2所示。
   
   
   图2 Alto与传统SPR工作流程对比

二、应用及优势
Alto的应用范围：适用于蛋白、抗体、核酸、小分子化合物、碳水化合物、脂质体、细胞、病毒和纳米颗粒等多种样品。该仪器具有以下特点和优势：

1. 高通量：一次可检测8个配体，48个分析物，实现24小时无间断运行。
2. 低样本量：仅需2 μL样本获得5条曲线，得到完整的动力学和亲和力数据，比传统SPR样本体积用量低近500倍。
3. 自动化操作：基于DMF技术，自动进行5个浓度的梯度稀释，减少人为误差，高重现性，无扩散及质传效应影响。
4. 易操作：软件指导式操作，自动报错提示及优化指导，无需清洗流路，发生机械故障可能性极低。

实验步骤

一、样品及缓冲液准备
此实验选用氨基偶联的固定方法，配体和分析物在对应孔中只需要加2 μL体积，相比传统SPR技术大大减少了样品使用量，为珍贵样品或难以获得样品提供了体外互作研究的机会，另外配体和分析物同步加入到卡盒，实现配体偶联和分析物分析不间断检测。

1. 样品准备：Alto实验推荐的配体实验浓度为25~50 μg/mL，且至少用醋酸钠溶液稀释20倍，一般用于稀释配体的醋酸钠pH为4.5或5.0，对于特殊配体需要进行预实验，通过检查偶联量以确定醋酸钠的pH；分析物在微流控板上以三倍梯度自动稀释成五个浓度进行测试，最高测试浓度设为亲和力的10倍，而加样浓度为最高测试浓度的3倍。若在亲和力未知的情况下，应预估亲和力范围，在该范围内设置对应浓度进行测试。
   配体的准备：取1 μL 1 mg/mL的CD32，加入19 μL 10 mM pH 4.5的醋酸钠溶液后混匀，配体CD32被稀释至50 μg/mL。
   分析物的准备：将分析物Fc初始上样浓度设为619 μM，体积40 μL，Buffer为PBS缓冲液。
2. PBST 缓冲液准备: PBST作为卡盒运行缓冲液，取1 mL 10× PBS用纯净水稀释10倍至10 mL，加入终浓度为0.1%的Tween-20，0.22 μm滤膜过滤。

二、软件程序设置

1. 打开控制软件，输入用户名及密码，点击“LOGIN”（图3），进入主页面（图4），点击“Design an experiment”进入程序设置页面（图5），选择“Binding Kinetics”和“Direct Kinetics”，直接动力学应用于将配体直接固定到传感器上，然后引入分析物以研究系统的结合动力学。
   
   
   图3 Alto 登陆页面
   
   
   图4 Alto主页布局
   
   
   图5 程序设计页面
   
   
2. 在图3中点击页面右下角“Create experiment”， 在创建新实验界面输入测试信息包括项目、实验名称和实验描述（图6），点击“Design an experiment”进入动力学实验设计页面（图7），在DIRECT KINETICS OPTIONS选项卡下选择多循环动力学“Standard (Multi-Cycle)”，在SURFACE选项卡下选择Sensor Chemistry为Carboxyl-PEG(KC-CBX-PEG-16)，在INTERACTIONS选项卡下勾选“Use auxiliary buffer”以实现缓冲液交换，设置分析物数量“Unique Analytes”为16，传感器(sensors)区域的温度设置为25 ℃，Reagents温度选择15 ℃，执行的稀释次数（Concentrations per Analyte）为默认固定值5次，不能修改；稀释倍数（Dilution Ratio）为默认固定值3倍梯度稀释。
   
   
   图6 定义参数以创建新实验
   
   
   图7 动力学实验设置页面
   
   
3. 点击“Create activities”，进入互作时间设置页面（图8）。互作实验流程（图8-图11）中各个液滴“Drop”的释义见表1。如图8所示，点击“Normalize”，此步骤为在任何样品到达传感器之前，用两种标准化溶液检测传感器，以检查每个传感器的灵敏度。每个液滴流过时间采取如图所示默认值；点击“Clean”,此步骤利用10 mM盐酸在传感器激活或配体固定之前冲洗传感器（图9）；点击“Bulid Surface”，此步骤里包含用溶剂冲平基线、用EDC-NHS活化芯片、在传感器上偶联配体、用乙醇胺进行芯片封闭，最后基线冲平，时间采取图10默认值；点击“Direct Single Cycle Kinetics”，此步骤用于将分析物液滴引入配体表面以测量结合动力学，分析物浓度应为实际测试浓度的三倍，结合时间设为180 s，解离时间设为600 s，其余时间采取图11默认值。
   
   表1 互作分析中各液滴对应释义
   
   
   图8 溶液校准的液滴顺序
   
   
   图9 清洗芯片的液滴顺序
   
   
   图10 配体偶联液滴顺序
   
   
   图11 分析物与配体互作时间设置
   
   
4. 点击“Manage samples”进入样品信息设置卡，根据卡盒加样位置对应填好样品名称及浓度，分析物浓度为必填项，配体放在C行，分析物样品放在D行和E行，卡盒加样信息设置如图12所示，点击“Build”，该方法将自动发送给检测仪器Alto。
   
   
   图12 样品信息. A.卡盒R行和A行加样名称设置，B.卡盒的B和C行加样名称和浓度设置，C.卡盒D和E行加样名称和浓度设置，D.卡盒BF行加样设置。
   
   

三、启动仪器，放置卡盒

1. 打开仪器侧方电源，等待仪器启动，仪器启动后，Alto控制软件将自动加载。
2. 登录后如图13，点击“Run an experiment”，选中上述建立的方法（图14），点击“Run”。
   
   
   图13 Alto 设备的主屏幕
   
   
   图14 选择方法
   
   
3. 拆开羧基芯片卡盒的密封包装，抓住卡盒边缘，注意将卡盒和卡盒托架的凹凸处对准后，如图15A红圈处，将卡盒水平放置。卡盒托架内的触发器用于仪器检测到卡盒。将含有硅油的注射器对准硅油孔，如图15B，待溶液完全注射进卡盒中，此过程需要1-3 min，小心提起注射器，应避免任何硅油的溢出和喷溅。
   
   
   图15 卡盒放置与注射硅油. A.卡盒放在托槽里，B.将硅油注射进卡盒。
   
   
4. 单击软件右下角的“Ready for samples”按钮，如图16所示，按照软件屏幕上的样品位置和体积信息，从卡盒顶部开始，依次向下一行将样品加载到卡盒对应的孔中，在屏幕上勾选加过样的孔以跟踪进度。加样时应使用反向移液技术，即用移液器时采用二挡位吸液一挡位打液的移液方式，将枪头尖端浸入硅油中，但不要接触底板，缓慢打出样品，以免产生气泡。加载完所有的样品后，点击“Run Experiment”。
   
   
   图16 卡盒各孔对应样品分布
   
   
5. 本实验进行16组实验，用时约7小时，实验结束后，及时取出卡盒，关闭仪器。

四、实验结果与数据分析

1. 实验完成后，数据将自动上传到控制软件主页上。单击导航栏中的“Analyze results”图4所示。从结果库中找到要分析的实验。将鼠标悬停在实验上，然后单击实验右侧的“View”，如图17所示。此时会弹出一个窗口，其中包含实验概述，如图18所示。
   
   
   图17 实验结果位置
   
   
   图18 实验结果概述
   
   
2. 点击左侧栏中的“Normalization”查看两种标准化溶液的传感器灵敏度校准结果，如图19所示，Drop2信号低于Drop4，说明传感器灵敏度良好。
   
   
   图19 传感器灵敏度校准结果
   
   
3. 点击左侧栏中的“Build Surface”查看配体偶联结果（图20），八个通道都成功偶联上配体CD32，偶联量具有一致性，最高的响应值达2,000RU。
   
   
   图20 CD32偶联结果
   
   
4. 点击左侧栏中的“Direct Kinetics”，等待1～5 min，可直接得到多循环动力学曲线和相互作用信息，互作数据术语的释义见表2。点击页面右上角设置图标，如图21A，在Analysis选项卡下，选择第二个分析模型“1:1 Langmuir Kinetic With Mass Transport Limitation (MTL) (Ka, Kd, Rmax, Kt)”，此模型是1:1结合模型，当分析物扩散到配体的速率比分析物与配体结合的速率慢时会对拟合结果产生影响，MTL模型可以矫正这一影响，适用于分析物与配体快速结合的曲线拟合。Rmax Value选择Local，Ka，Kd，Kt选择Global，点击“Apply changes”。如图21B，在Clean up选项卡下，勾选Despick以消除突然急剧增加或减少的局部噪音；勾选“Averaging”降低传感器图中的噪声，提高数据的可视化，减少拟合误差；勾选“Trim baseline”，将结合曲线前的基线缩短，使曲线更流畅；“Baseline Drift Correction”对结合前基线时间大于200 s的基线进行矫正，此处不做勾选，点击“Apply changes”。拟合后的一组数据页面如图22所示，左侧显示出CD32与Fc相互作用的重要参数，KD为18.4 μM，点击右上角第六个图标，实验结果曲线图可直接导出为用于文章发表的矢量图（图23）。
   
   表2 相关术语及释义
   

   术语	释义
   Ka	结合速率
   Kd	解离速率
   KD	亲和力、kd/ka或平衡常数
   Rmax	计算出的最大结合反应，是试剂活性、表面反应物量和分子量的函数
   Chi2	Chi2表示拟合的优度
   Kt	质量传递系数，分子从体向表面转移的扩散速率

   
   
   图21 数据拟合选项。 A. 数据分析选择模型页面；B. 调整拟合曲线页面。
   
   
   图22 动力学拟合结果页面
   
   
   图23 可用于发表文章的矢量结果图

实验注意要点

1. 本实验中在拆开卡盒的真空包装后一定要在30 min内加入硅油，否则长时间暴露在空气中将对卡盒芯片产生不利影响；卡盒为一次性使用耗材。
2. 一般来说，对于良好的拟合，Chi² 的平方根与测量的噪声大小相同，Chi²的数值应当越小，数据质量越好。另一个参考标准是Chi² 与Rmax的比值在10%以内。
3. 本文介绍实验为一对一相互作用研究，且不需要芯片再生步骤。对于一对多的筛选实验，每个通道最多可以对应6个分析物，一个卡盒最多进行48个分析物的研究，但是也要考虑芯片是否需要再生，芯片再生后可能会造成配体活性下降，从而降低分析物分析个数。
4. DMF技术利用油包水的特性，在电极下推动液滴进行检测，所以凡是破坏硅油形成疏水表面的有机溶剂，都不能使用。
   

溶液配方

1. PBST 缓冲液成分
   NaCl 0.137 M，KCl 0.0027 M，Na₂HPO₄ 0.01 M，KH₂PO₄ 0.0018 M，0.1% Tween-20。
   

致谢

本实验方案得到高校国家重大科技基础设施开放共享和运行维护经费项目（61100600123）和生命结构前沿研究中心资助项目（997019045）的经费支持。
感谢北京拓澳生物有限公司让文亮工程师在实验操作方面给与的帮助。

参考文献

1. APPLICATION NOTE: Characterization of Fc Gamma Receptor and IgG Interactions using Alto™: Comparison to BLI.
2. Junker F, Gordon J, Qureshi O. (2020). Fc Gamma Receptors and Their Role in Antigen Uptake, Presentation, and T Cell Activation. Front Immunol 11:1393.
3. Zou G, Ochiai H, Huang W, et al. (2011). Chemoenzymatic Synthesis and Fcγ Receptor Binding of Homogeneous Glycoforms of Antibody Fc Domain. Presence of a Bisecting Sugar Moiety Enhances the Affinity of Fc to FcγIIIa Receptor. J Am Chem Soc. 133(46):18975.

Copyright: © 2025 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.

引用格式：刘俊华, 常卿, 李文奇. (2025). 利用Alto LSPR检测蛋白配体与受体相互作用亲和力. // Surface Plasmon Resonance (SPR) Protocol eBook. Bio-101: e1011027. DOI: 10.21769/BioProtoc.1011027.
How to cite: Liu, J. H., Chang, Q. and Li, W. Q. (2025). The Binding Affinity Analysis of Protein Ligand Interacting with Receptor by Alto LSPR . // Surface Plasmon Resonance (SPR) Protocol eBook. Bio-101: e1011027. DOI: 10.21769/BioProtoc.1011027.