Recovery of Biosensor Chips and Remake of CM Chip   

材料与试剂

1. 废弃生物传感芯片（Cytiva，Cytiva，CM5、CM7、SA等芯片）
2. 裸金芯片（Cytiva，Cytiva，SIA Kit Au：BR-1004-05）
3. 乙醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，Aladdin，AR：E111989-500mL）
4. 浓硫酸（天津市津东天正精细化学试剂厂，津东天正，AR）
5. 双氧水（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，Aladdin，AR，30 wt% in H2O：H112515-500mL）
6. 11-巯基十一醇（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，Sigma-Aldrich，97%）
7. 环氧氯丙烷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，Aladdin，AR，99.5%）
8. 二乙二醇二甲醚（安徽泽升科技有限公司，安耐吉化学，99.5%）
9. 葡聚糖（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，Aladdin，Mw = 1500、25000、60000 以及500000 g/mol，AR，99.5%）
10. 溴乙酸（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，Sigma-Aldrich，97%）
11. 透明双面胶（丰裕工业胶带，皇冠，PET透明双面胶带：7982）
12. 牛血清蛋白（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，Aladdin，96%）
13. 氨基偶联试剂盒（Cytiva，Cytiva，Amine Coupling Kit：catalog number: BR100050）
14. 醋酸钠缓冲溶液（Cytiva，Cytiva，Acetate 4.0：catalog number: BR100349）
15. 98% H₂SO₄/30% H₂O₂（7:3）溶液（见溶液配方）
16. 11-巯基十一醇溶液（见溶液配方）
17. 表氯醇溶液（见溶液配方）
18. 葡聚糖（Dextran）水溶液（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 生物分子相互作用分析仪（Cytiva，Cytiva，catalog number: Biacore T200）
2. 微孔板恒温振荡器（杭州米欧仪器有限公司，MIU LAB，catalog number: ST70-2）
3. 氮吹仪（杭州米欧仪器有限公司，MIU LAB，catalog number: NDK200-1N）
4. 干式金属浴（杭州米欧仪器有限公司，MIU LAB，catalog number: DHT-100）
   

实验步骤

1. 回收芯片，获得金膜芯片
   将废弃的生物传感芯片从芯片外壳中取出，浸泡于80%乙醇溶液中24 h，使硅胶溶解 以取下沾在塑料框架上的金膜芯片。室温下，将金膜放置于24孔板并浸泡于2 mL 98% H₂SO₄/30% H₂O₂溶液中，300 rpm振荡浸洗30 min，中间翻转金膜数次，去掉金膜表面包括失活的配体分子、葡聚糖凝胶和11-巯基十一醇等有机成分，去离子水洗5次，氮气吹干后，得到具有裸金表面的金膜芯片（实验体系参考李雪玲等[1]）。
2. 重构芯片表面基质
   将金膜芯片置于5 mL离心管中，加入2 mL 5 mM 11-巯基十一醇溶液，将离心管放置于金属浴中40 ℃孵育30 min，然后依次用80%乙醇、去离子水各洗5次，11-巯基十一醇作为功能结构可进一步修饰，同时阻止生物分子的非特异性吸附。将上面处理过的芯片加入0.6 M表氯醇溶液中，在金属浴中25 ℃孵育4 h，依次用去离子水洗2次，80%乙醇洗两次，去离子水洗5次，表氯醇处理生成环氧基用于下一步葡聚糖共价修饰（实验条件参考欧惠超等[2]）。
3. 葡聚糖修饰及羧基化，获得CM芯片
   将重构基质后的金膜芯片置于24孔板，浸泡于2 mL不同浓度的葡聚糖（Dextran）水溶液中，25 ℃下300 rpm振荡孵育20 h，50 ℃去离子水洗5次。将上述Dextran修饰后的金膜芯片加入1 M溴乙酸中，25 ℃下300 rpm振荡孵育18 h，使Dextran凝胶羧基化，去离子水洗5次，氮气吹干，得到CM芯片。
   
   
   图 1. 生物传感芯片回收与重制实验流程示意图
   
   
4. 芯片组装
   利用SIA Kit Au中的工具包，将重制后的CM芯片用裁剪好的透明双面胶粘贴于塑料框架上，并插入芯片外壳。芯片组装完成后，放入自封袋4 ℃储存。
   
   
   图 2. SPR芯片组装示意图
   

实验注意要点

1. 组装芯片时，注意区分芯片的正反面，即经过化学修饰的金膜面和玻璃基底面。一旦用透明双面胶错误粘贴，则芯片无法再次取下、重新组装。
2. 粘贴、按压芯片不宜用力过大，以免导致玻璃基底断裂，导致芯片无法使用。
   

结果与数据分析

1. 芯片偶联量测试
   采用牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为实验样本，检测重制CM芯片的偶联量，同时参考芯片活化的ΔR值，依次考察pH值、葡聚糖浓度和种类的影响，优化CM芯片的重制条件。偶联实验条件如下：
   重制CM芯片采用N-羟基丁二酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide，EDC）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，NHS）混合液（体积比1：1）预先活化420 s，然后将醋酸钠缓冲盐溶液（pH=4.0）稀释BSA的100 μg/mL溶液进样420 s，随后用乙醇胺盐酸盐进行封闭进样420 s（图3）。对比BSA蛋白偶联前后的SPR曲线差值可以得知蛋白偶联量，由于实验中采用了较大的BSA浓度和较长的进样时间，因此该偶联量可以反映出芯片蛋白偶联量的最大能力（偶联性能评价参考沈广宇等[3]）。对比活化前后的SPR曲线差值ΔR则可以反应出芯片表面可用于偶联的活性位点的多少，通常与芯片偶联蛋白容量大小是一致的。
   
   
   图3. CM芯片偶联性能测试示意图
   
   
2. 重构基质阶段pH值的影响：
   
   
   图 4. 不同pH值下重制CM芯片单通道最大偶联量
   
   实验初期，采用类似正交实验的方法，初步考察在重构基质阶段pH值及葡聚糖浓度对于芯片偶联蛋白量的影响（图4），可以看到在0.1 M NaOH条件下，重制CM芯片就能获得一个较高的蛋白偶联量，因此，在后续的实验中，重构基质的pH条件均采用0.1 M NaOH。另外，当葡聚糖浓度增大到一定含量后，重制CM芯片的蛋白偶联量反而下降。
   用于修饰的葡聚糖种类的影响
   本实验中用到的葡聚糖为右旋糖苷（Dextran），是一类种类丰富的多糖。为了优化出合适的Dextran，实验考察了采用四种不同分子量的Dextran（Mw = 1500、25000、60000 以及500000 g/mol）对重制CM芯片单通道最大偶联量的影响（图5），可以看出，采用分子量较大的Dextran用于修饰芯片，可以获得较高的蛋白偶联量，Dextran-500000及Dextran-25000所修饰的芯片都具备较好的蛋白耦连能力。另外，对于同一Dextran，葡聚糖浓度提高时，并不总是对应蛋白的偶联量的提高，尤其是对于较大分子量的Dextran而言。另外，考察CM芯片蛋白偶联能力时，可以参考ΔR值的大小（图5内插图），ΔR值的变化趋势与蛋白最大偶联量基本保持一致。
   
   
   图 5. 修饰不同分子量葡聚糖下重制CM芯片单通道最大偶联量
   

溶液配方

1. 98% H₂SO₄/30% H₂O₂（7:3）溶液
   即食人鱼洗液，用量筒分别量取体积比为7:3的98% H₂SO₄及30% H₂O₂，先将浓硫酸倒入烧杯中，再将30% H₂O₂缓慢滴入浓硫酸中，同时用玻璃棒不停搅拌。食人鱼洗液每次使用前现用现配，使用后的食人鱼洗液经纯水稀释后倒入酸液废液桶中。
2. 11-巯基十一醇溶液
   称量一定质量的11-巯基十一醇粉末，溶于80%乙醇中，使得11-巯基十一醇终浓度为5 mM，溶液储存于棕色容量瓶中，室温避光存放。
3. 表氯醇溶液
   先配制体积比为1:1的0.4 M NaOH和二乙二醇二甲醚溶液，并将二者混匀，然后量取一定体积的环氧氯丙烷，溶于上述溶剂中，使得环氧氯丙烷的终浓度为0.6 M，溶液储存于棕色容量瓶中，室温避光存放。
4. 葡聚糖（Dextran）水溶液：以 0.3 g/L Dextran-60000葡聚糖溶液为例：称量0.025 g的Dextran-60000葡聚糖粉末，溶于5 mL去离子水中，使得葡聚糖储液浓度为5 mg/mL，然后量取120 μL的葡聚糖储液与100 μL的2 M NaOH储液混合，再用1780 μL去离子水稀释，使得溶液中葡聚糖终浓度为0.3g/L且NaOH终浓度为0.1 M，葡聚糖溶液应现用现配，葡聚糖储液及2 M NaOH储液可4 ℃冷藏存放。
5. 溴乙酸：称量一定质量的溴乙酸粉末，溶于2 M NaOH溶液中，使得溴乙酸终浓度为1 M，溶液储存于玻璃溶剂瓶中，室温存放。
   

致谢

本研究得到了“南开大学大型仪器实验技术研发项目”的资助，感谢南开大学及设备处对于大型仪器技术、方法开发等工作的大力支持。本实验方法着重参考了欧惠超博士的研究工作“基于SPR技术的传感芯片的研制及其应用”，在此致谢欧惠超、罗昭峰和宋存先等老师的研究工作。

参考文献

1. 李雪玲，方志俊 ，黄明辉，曹慧敏，赵建龙，杨梦苏.(2007) 一种葡聚糖芯片的再生方法、表征及其应用. 中国生物工程杂志，27：59-62.
2. 欧惠超，姜 浩，周宏敏，李磊珂，白林静，宋存先，罗昭锋.(2009) 五种 SPR传感芯片的再生制备及其应用. 中国生物工程杂志，29：44-49.
3. Shen G. Y., Wang S., Wang H., Tan S. Z., Li J. S., Shen G. L. and Yu R. Q.(2005) Detection of antisperm antibody in human serum using a piezoelectric immunosensor based on mixed self-assembled monolayers. Analytica Chimica Acta, 540：279-284.