摘要: 自2019年底第一例新冠阳性病例确诊以来,SARS-CoV-2病毒已经在全球造成了超过4亿人次的感染。SARS-CoV-2病毒的刺突(S)蛋白介导病毒与宿主细胞表面的hACE2受体结合,是抗SARS-CoV-2病毒抗体药物开发的理想靶标。S蛋白与 hACE2结合的关键区域被称为RBD区域,使用中和抗体阻断RBD与hACE2的结合可有效阻止SARS-CoV-2病毒感染。然而,由于SARS-CoV-2是单链病毒,非常容易突变,目前已有许多突变毒株的产生,抗体的广泛中和能力也是一个重要的考量因素。在本实验案例中,从康复患者B细胞中克隆并筛选得到了多个对SARS-CoV-2病毒具有强效中和作用的抗体[1]。接下来,使用表面等离子共振仪Biacore 8K对这些中和抗体分别与SARS-CoV-2 RBD进行亲和力和动力学检测。结果发现候选抗体A5的亲和力最强,有潜力成为预防和治疗SARS-CoV-2感染的一种有前途的抗体。
关键词: 表面等离子共振仪, 药物筛选, 中和抗体, Biacore
研究背景
SARS-CoV-2病毒的出现后已迅速发展为全球大流行,导致严重的健康和经济负担。鉴于冠状病毒爆发的紧迫性,科学家们提出以高通量的方式筛选针对冠状病毒的潜在广谱药物,特别是针对SARS-CoV-2 ,从而快速准确地筛选出针对新出现和突变的冠状病毒。抗体药物高通量筛选是指应用适当的筛选技术和方法对可能作为药物使用的抗体进行药理活性检测。近年来新发展的药物筛选技术包括磁共振、表面等离子体共振、质谱、差示扫描荧光、微流控芯片等技术[2]。
表面等离子体共振(SPR)是一种非常敏感的实时监测两个物质之间结合的技术[3]。在一个典型的SPR实验中,配体蛋白被固定在传感芯片上,小分子或抗体蛋白流过配体蛋白表面时若发生结合作用,会引起SPR角的变化,形成能够检测的结合响应信号。通常,配体蛋白通过与赖氨酸的共价连接或通过亲和捕获方法,如生物素或多组氨酸标签或Fc受体,将目标蛋白固定在传感芯片上。Biacore是基于SPR技术来实时跟踪记录生物分子间相互作用的表面等离子共振仪,可以允许每天测量几十甚至数百个分子,具有高通量、非标记、高灵敏度、实时监测等特点,特别适合早期药物筛选和验证。
材料与试剂
- 重组SARS-CoV-2 S trimer (AcroBiosystems,产品目录号:SPN-C5223)
- S系列CM5芯片 (Cytiva, Series S Sensor Chip CM5, 产品目录号: 29149603)
- 氨基偶联试剂盒 (Cytiva, 产品目录号: BR100050, 内含N-Hydroxysuccinimide (NHS) 115 mg 和1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) 750 mg。
- 醋酸钠缓冲液 ( Cytiva, Acetate 4.5, 产品目录号: BR100350; Acetate 5.0, 产品目录号: BR100351; Acetate 5.5, 产品目录号: BR100352)
- 96孔板 (Cytiva, 产品目录号: BR100503)
- 96孔板封膜 (Cytiva, 产品目录号: 28975816)
- 10× PBS缓冲液 (Cytiva, 产品目录号: BR100672)
- 10× HBS-EP缓冲液 (Cytiva, 产品目录号: BR100669)
- 50 mM NaOH溶液 (Cytiva, 产品目录号: BR100358)
- Glycine 1.5缓冲液 (Cytiva, 产品目录号:BR100354)
- 1.5 mL EP管 (Axygen, 产品目录号: BCT-150-C)
- 中和抗体和hACE2蛋白 (上海交通大学药学院朱建伟课题组制备)
- 0.22 µm过滤膜 (CNW, 产品目录号:SCEQ-CM0612)
- ZebaTM 脱盐离心柱 (Thermofisher, 产品目录号:89882)
- 1.0× PBS缓冲液 (见溶液配方)
- 1.0× HBS-EP缓冲液 (见溶液配方)
- 配体蛋白母液 (见溶液配方)
- 中和抗体药物和hACE2母液 (见溶液配方)
- EDC+NHS混合液 (见溶液配方)
仪器设备
- 纯水仪 (密理博, Milli Q)
- 表面等离子共振仪 (Cytiva, Biacore 8K)
- 台式离心机 (赛默飞, Micro21R)
- 真空过滤器 (CNW)
实验步骤
一、实验准备
打开Biacore 8K仪器和控制软件(版本号4.0.8.20368),输入软件登录密码。流动池和样品舱的温度均设置为25 ℃。
将仪器右侧标记Buffer A的管路插入1.0× PBS缓冲液试剂瓶里,将标记Buffer BCD、Water和Reagent的管路插入超纯水的试剂瓶。
在Biacore 8K Control Software的System setup模块,点击Change chip,点击右侧Undock chip,芯片舱打开,拿出维护芯片,按照芯片盒箭头指示方向放入新的CM5芯片,关闭芯片舱。在仪器控制软件右侧选择New chip,填写芯片相关信息,然后点击Dock chip。
在Biacore 8K Control Software的System setup模块,点击Change solutions,选择Buffer position A,其余默认设置,点击Ready to start。缓冲液会以较高的流速冲洗仪器整个内部流路系统,整个过程耗时6分钟。。
二、配体偶联
(1)配体蛋白固定在CM5传感芯片上的原理
CM5传感芯片经过活化处理,表面会暴露羧基基团。蛋白由于富含氨基基团,通过和羧基发生共价反应而固定在芯片表面。为了提高蛋白共价连接在芯片上的效率,需将蛋白预先富集在芯片表面。芯片表面由于含有大量葡聚糖基质而带负电荷。如果用低于蛋白等电点的缓冲液稀释蛋白,则蛋白携带正电荷,通过电荷的作用,蛋白被有效预富集在芯片表面。因此在固定配体蛋白之前需要进行预富集实验,以便确定稀释蛋白的缓冲液pH、蛋白浓度和固定时间等条件。
(2)计算配体偶联量
根据以下公式计算配体目标偶联量:
其中,Rmax为芯片表面最大结合容量,通常设为100 RU;Analyte MW为中和抗体分子量,ligand MW为S trimer分子量;Sm为化学计量比,通常设成1;RL为配体偶联水平,配体目标偶联量通常设为1.5倍的RL。在本研究案例中,SARS-CoV-2 S trimer 分子量为480-570kDa,中和抗体的分子量为150 kDa。经公式计算,SARS-CoV-2 S trimer目标偶联量为300-600 RU,由于抗体与抗原互作时,配体蛋白固定量偏高会引起舞蹈效应,导致两者之间的解离障碍,因此在实际固定S trimer蛋白时偶联量可以适当降低。
(3)配体预富集
为了实现配体蛋白与芯片的偶联,需考察配体分子富集在芯片上的条件,特别是SARS-CoV-2 S trimer蛋白适用的溶液pH。根据蛋白等电点(SARS-CoV-2 S trimer等电点约为6.2),分别使用10 mM pH 5.5、10 mM pH 5.0和 10 mM pH 4.5的醋酸钠溶液稀释SARS-CoV-2 S trimer蛋白至2 μg/mL。
在Biacore 8K Control Software里,选择Method,点击 New,选择Surface preparation,打开pH scouting方法。方法里包含四个步骤。第一步Method definition,设置Analyte的Contact time为180 s;第二步Variables and positioning,选择channel 1-3,分别设置为10 mM pH 5.5、10 mM pH 5.0和 10mM pH 4.5缓冲液稀释,修改Analyte Solution名称为SARS-CoV-2 S trimer,Immobilization buffer 分别设置为10mM acetate pH 5.5、10mM acetate pH 5.0和10mM acetate pH 4.5。第三步Cycle overview不需要做任何改动;第四步Plate layout,显示了96孔板里样品放置位置和需要体积。按照第四步的要求将样品加到96孔板里,Volume的体积≥系统显示体积。
在Biacore 8K Control Software的Instrument control界面,Hotel door处点击open,把样品架从样品舱里取出来,把加好样品的96孔板放置到样品架上,然后放到仪器里面,把样品舱的门关闭。在Methods界面,点击第四步Plate layout后面的Send to queue,查看样本板位置是否放置正确,在Buffer positon 处点击Bottle A,查看系统要求的溶液体积是否满足需求,点击Ready to start和Save,方法开始运行。
运行结束后,在Biacore 8K Control Software的Runs界面,打开保存的数据(图1)。预富集实验结果显示,利用10 mM pH 4.5、10 mM pH 5.0和 10mM pH 5.5的醋酸钠溶液稀释SARS-CoV-2的S trime蛋白,进行pH scouting测试时样品的信号分别增加约800RU,600RU和200RU。显然,pH 5.0的醋酸钠溶液稀释时样品信号响应比pH 5.5高。虽然pH 4.5的醋酸钠溶液稀释时信号响应更高,但是考虑到蛋白质在酸性条件下的稳定性,且我们的目标偶联量是300-600RU,10mM pH 5.0的醋酸钠溶液稀释时样品的信号响应完全满足需求,因此选择10mM pH 5.0的醋酸钠溶液作为配体蛋白的稀释溶液用来固定S trime蛋白。另外在做pH scouting的反应时间为180 s,此时的响应值增加约600U, 满足偶联量的要求,最终我们选择10mM pH 5.0的醋酸钠溶液稀释配体蛋白,固定时间180 s,配体蛋白浓度2 μg/mL。
图1. pH scouting测试传感图。蓝色为10 mM pH 5.5醋酸钠溶液稀释样品的响应信号;橘黄色为10 mM pH 5.0醋酸钠溶液稀释样品的响应信号;绿色为10 mM pH 4.5醋酸钠溶液稀释样品的响应信号。
(4)配体偶联
在Biacore 8K Control Software里,点击New method,选择Surface preparation,打开Immobilization方法。方法里包含两个步骤。第一步Method definition,选择Immobilize in Fc 2, activate/deactivate in 1,点击Enter custom mode。点击EDC+NHS,输入solution的名称为EDC+NHS,去掉mix with前面的√。Contact time和flow rate设置不改变,Wash和Ethanolamine设置不改变,Ligand的Contact time设置为180 s,Flow rate 设置为10 µl/min。Channel选择1-8。第二步Positioning and plate layout,选择View的Trays模式,可以用鼠标拖动plate上样品放置位置。界面右侧显示了96孔板里样品放置位置和需要体积。按照要求将样品加到96孔板里,Volume的体积必须≥系统显示体积。其中EDC、NHS和Ethanolamine用氨基偶联试剂盒的配套试剂,SARS-CoV-2 S trimer 蛋白用10 mM pH 5.0的醋酸钠稀释至2 μg/mL。
在Biacore 8K Control Software的Instrument control界面,在Hotel door处点击open,把样品架从样品舱里取出来,把加好样品的96孔板放置到样品架上,然后放到仪器里,关闭样品舱的门。在Methods界面,点击第二步Positioning and plate layout后面的Send to queue,查看样本板位置是否放置正确,在Buffer positon 处点击Bottle A,查看系统要求的溶液体积是否满足需求,点击Ready to start和Save,方法开始运行。
运行结束后,在Biacore 8K Control Software的Runs界面,打开保存的数据,选择Results查看蛋白偶联量,结果显示SARS-CoV-2 S trimer蛋白偶联了100~300 RU,比计算的理论值(300-600 RU)偏低,符合偶联量偏低的预期,满足后期动力学和亲和力测试要求。
三、新型冠状病毒广谱中和抗体的筛选
(1)结合测试
前期研究工作中,研究者从康复患者B细胞中克隆并筛选得到10个广谱中和抗体,可能作为潜在的抗体药物,抑制SARS-CoV-2 S trimer和hACE2结合。
接下来,使用Biacore 8K对这10个抗体药物与SARS-CoV-2 S trimer和中和抗体的结合能力进行了检测,目的是初步确定抗体与配体蛋白是否存在相互作用;若存在相互作用,确定进行动力学和亲和力测试时抗体的浓度范围,以及再生试剂种类和时间等条件。
将仪器右侧标记Buffer B的管路插入1.0× HBS-EP缓冲液试剂瓶里,将标记Buffer CD、water和reagent的管路插入超纯水的试剂瓶。
在Biacore 8K Control Software的System setup模块,点击Change solutions,默认设置,点击Ready to start。
在Biacore 8K Control Software,点击New method,选择Kinetics/affinity,在Antibody/general里选择 Kinetics/affinity,打开 Mµlti-cycle kinetics/affinity方法。第一步Method definition,将Concentration unit改成 µg/mL,Running buffer设置为HBS-EP,去除Startup步骤。在Analysis里,Analyte的Contact time设置成120 s,Dissociation time设置成120 s, 流速30 µL/min。Regeneration的 solution 设置为Glycine 1.5,contact time设置为30 s,流速30 µL/min。第二步Variables and positioning,在Analysis里,编辑 cycle数为4个,将Analyte Solution改为抗体蛋白名称,浓度分别设置成0、0、50、50 µg/mL。第三步Cycle overview不需要做任何改动。第四步Plate layout,将样品配好加到96孔板里,其中0浓度和HBS-EP为1× HBS-EP缓冲液。96孔板放到仪器里,点击 Send to queue,点击Ready to start和Save,方法开始运行。
运行结束后,结果表明(1)SARS-CoV-2 S trimer和50 μg/mL中和抗体互作时的结合响应满足测试需求,因此用50 μg/mL中和抗体2倍梯度稀释,共8个浓度点。(2)Glycine 1.5能够将系统再生完全,且不影响配体蛋白活性,因此选择Glycine 1.5做为再生试剂。(3)Biacore做动力学测试时,结合和解离时间是基于分析物结合解离后获得的传感图来确定的。理论上解离时间是信号回到基线的原始水平或者复合物实现一半解离的时间。但是在实际操作中,有些分析物很难解离,短时间内信号无法回到基线或复合物解离一半。当解离时间太短时,导致解离曲线太短,这时很难分析强结合(kd>10-4s-1),而长的解离时间是不切实际的。根据经验,在尝试分析之前,解离曲线信号响应需至少降低5%。对于10-4s-1的解离常数,这将导致至少12分钟的解离时间。此外,系统需要足够长“解离”时间的空白注射来补偿可能的基线漂移[4]。在本实验案例中,SARS-CoV-2 S trimer与中和抗体的解离过程比较缓慢,为了更准确测试解离常数,需要延迟互作的解离时间。
(2)动力学/亲和力测试
接下来,使用Biacore 8K对分析物(10个抗体药物与hACE2蛋白)与SARS-CoV-2 S trimer的亲和力和动力学进行检测。
分别使用1×HBS-EP溶液稀释中和抗体至50 μg/mL,稀释ACE2蛋白至120 μg/mL,再用1×HBS-EP溶液配制蛋白浓度梯度,2倍稀释,共8个浓度点。
在Biacore 8K Control Software,点击New method,选择Kinetics/affinity,在Antibody/general里选择 Kinetics/affinity,打开 Multi-cycle kinetics/affinity方法。第一步Method definition,将Concentration unit改成 µg/mL,Running buffer设置为HBS-EP。在Analysis里,Analyte的Contact time设置成270 s,Dissociation time设置成270 s。Molecµlar weight设置为150000(中和抗体)或者1200000(hACE2)。将Startup里的Analyte设置成和Analysis里完全一样的实验条件。第二步Variables and positioning,在Analysis里,Add cycle至12个循环,将Analyte Solution改为抗体蛋白名称,中和抗体浓度分别设置成0、0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、6.25、12.5、25、50、0 μg/mL;蛋白hACE2蛋白浓度分别设置为0、0、0.9375、1.875、3.75、7.5、15、15、30、60、120、0 μg/mL。在Startup里,Add cycle至5个循环。第三步Cycle overview不需要做任何改动。第四步Plate layout,将样品配好加到96孔板里,其中0浓度和HBS-EP为1×HBS-EP缓冲液。96孔板放到仪器里,点击 Send to queue,点击Ready to start和Save,方法开始运行。
由于Channel 1-8固定SARS-CoV-2 S trimer蛋白,使用Biacore 8K仪器一次可以做8个中和抗体的动力学测试。在本实验案例中,10个中和抗体和1个hACE2蛋白需要使用Biacore 8K仪器做二轮实验可以获得它们的动力学和亲和力常数。
实验注意要点
- 配体偶联:
对于抗原和抗体相互作用实验,在保证检测灵敏度的情况下抗原的偶联量尽量降低,减少互作分析中干扰判断的舞蹈效应,特别是针对具有极其高亲和力的抗体。 - 再生条件摸索:
用CM5芯片做抗原抗体互作测试时,需要选择合适的再生条件,既能满足将分析物洗脱干净的要求,又要保证配体蛋白的活性基本不受影响。因此在动力学和亲和力测试之前用结合测试实验考察再生试剂的效果,筛选合适的再生试剂和再生时间非常重要。 - 动力学和亲和力测试:
抗原和抗体的往往具有极高的亲和力,且两者之间的解离速度很慢,这时需要延长测试时的解离时间,否则会影响动力学和亲和力测试数据的有效拟合,导致KD测试产生误差。另外如果需要获得亲和力常数的偏差值,可以重复2次及以上抗原抗体互作的测试。
结果与数据分析
(1)中和抗体与SARS-CoV-2 S trimer的亲和力和动力学检测:
使用Biacore 8K的分析软件Biacore Insight Evaluation software对结果进行分析。在Create new evaluation界面,找到要处理的文件,点击Select evaluation method,在Predefined界面,选择Kinetics/affinity里的Antibody/general,双击 multi-cycle kinetics-Evaluation method。仪器默认会把进样前后的部分曲线截掉,如果不想截掉,点击图右侧的小齿轮,在Remove range里,去掉勾选的Remove ranges at start and end of injections。在Settings中选择Serials,在Kinetics/Affinity mode点击Kinetics,Fit models选择1:1 binding模型,在Initial values里,Rmax选择Fit local,点击Perform fit,即得到拟合结果,包括结合速率ka,解离速率kd,Rmax和亲和力KD。
如图2,结果显示有5个中和抗体药物与SARS-CoV-2 S trimer有特异性结合,亲和力范围是0.9 nM到35 nM。其中,A5的亲和力最强,并且具有较慢的解离速率,提示A5能够有效阻断S蛋白和hACE2之间的相互作用,可以做为潜在的抗体药物用于临床治疗。
![](https://en-cdn.bio-protocol.org/attached/image/20240408/20240408011705_0218.png)
图2. Biacore 8k检测中和抗体或hACE2与SARS-CoV-2 S trimer的亲和力和动力学传感图
溶液配方
- 1.0× PBS缓冲液
量取100 mL 10× PBS缓冲液,加900 mL超纯水,使用0.22 µm过滤膜和真空过滤装置将溶液过滤到装缓冲液的瓶子里。 - 1.0× HBS-EP缓冲液
量取100 mL 10× HBS-EP缓冲液,加900 mL超纯水,使用0.22 µm过滤膜和真空过滤装置将溶液过滤到装缓冲液的瓶子里。 - 配体蛋白母液
将SARS-CoV-2 S trimer蛋白用超纯水溶解成1 mg/mL母液。利用ZebaTM 脱盐离心柱和离心机按照厂家使用说明用1.0× PBS缓冲液对SARS-CoV-2 S trimer进行缓冲液置换。利用BCA方法测试蛋白浓度。 - 中和抗体药物和hACE2母液
纯化的中和抗体蛋白和hACE2蛋白,溶于PBS缓冲液,BCA方法测试蛋白浓度。 - EDC+NHS混合液
将氨基偶联试剂盒内的NHS和EDC分别用10 mL超纯水溶解混匀,分装在离心管中,-20 ℃保存。配体偶联时,取分装的EDC和NHS溶液,按照体积比=1:1混合配制EDC + NHS混合液。
致谢
感谢上海交通大学药学院中国教育部细胞和治疗抗体工程研究中心朱建伟教授课题组提供实验数据。感谢唐浩能同学的帮助。
参考文献
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Copyright: © 2024 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:侯敬丽, 唐浩能. (2024). 新型冠状病毒广谱中和抗体药物的筛选.
Bio-101: e1011008. DOI:
10.21769/BioProtoc.1011008.
How to cite: Hou, J. L. and Tang, H. N. (2024). Screening of Broad-spectrum Neutralizing Antibody Drugs for Novel Coronavirus.
Bio-101: e1011008. DOI:
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