摘要: 神经营养因子(Neurotrophins, NTs)对外周和中枢神经元的存活、分化和维持发挥着关键调节作用。p75NTR是神经营养因子两类受体之一,可结合所有的NTs。在研究NTs与受体p75NTR的结合机制中,我们获得了NT-3与糖基化p75NTR胞外域的晶体结构。晶体结构中糖基化p75NTR与NT-3的结合方式是2:2的对称形式,而更早报道的去糖基化p75NTR与NGF的结合方式是1:2,说明p75NTR的糖基化影响了互作机制。为进一步了解糖基化和去糖基化受体p75NTR与NT-3互作的区别,我们使用Biacore 3000仪器,检测了糖基化和去糖基化受体p75NTR分别与NT-3的亲和力。在亲和力数据计算中,我们采用了动力学和平衡态两种拟合方式,结果均显示去糖基化造成了亲和力的下降。
关键词: Biacore, 神经营养因子, 神经营养因子受体, p75NTR, dg-p75NTR
材料与试剂
- CM5芯片(Cytiva,BR100012)\
- 氨基偶联试剂盒(Cytiva,BR-1000-50)
- 10 mM醋酸钠 pH 5.0(Cytiva,BR100351)
- 10 mM醋酸钠 pH 5.5(Cytiva,BR100352)
- 10 mM醋酸钠 pH 4.5(Cytiva,BR100350)
- 糖基化p75NTR胞外域蛋白和去糖基化p75NTR(dg p75NTR)胞外域蛋白,均为实验室表达纯化1,缓冲液为PBS。NT-3蛋白由Genentech公司赠送。
- NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、HCl、NaOH为国药集团化学试剂有限公司产品,Tween 20为SIGMA-ALDRICH(货号为P1379-100ML)产品。
- 其他耗材:1.5 mL EP管, 1 mL, 200 µL, 10 µL枪头均为Axygen公司产品。
- 0.22 μm 微孔滤膜
仪器设备
- Biacore 3000 (GE, Healthcare)
- 超纯水仪(Millipore)
实验步骤
一、Biacore实验前准备
- 运行缓冲液PBST的制备:溶解8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4在800 mL蒸馏水中,使用HCl调节pH值至7.4,加纯水和0.05 mL的Tween 20定容至1 L,使用前0.22 μm 微孔滤膜抽滤,取500 mL使用。
- 0.5 M NaOH配置:称取2 g NaOH粉末,用100 mL纯水溶解,备用。5 mM NaOH,50 mM NaOH均用0.5 M NaOH稀释。
- 停止Biacore 3000 standby状态,点击undock,将维护芯片更换为CM5芯片,放入500 mL运行缓冲液PBST,Prime。仪器实验温度维持25 ℃。
- 氨基偶联试剂按照说明,EDC和NHS分别用10 mL纯水溶解,充分混匀后,分装至EP管,-20 ℃保存备用。
二、配体NT-3的偶联- NT-3预富集实验。采用手动模式,点击Run Sensorgram,选择Fc3,输入flow rate 20 μL/min,进样选择inject模式,进样10 mM pH 5.5、pH 5.0和pH 4.5醋酸钠稀释的20 μg/mL NT-3蛋白,选择富集效果好的pH条件(图1)。
- 配体偶联。Fc2选择作为固定通道,流速10 μL/min ,将EDC和NHS 1:1混匀作为活化剂,进样7 min, 随后注射6 μL pH 5.5醋酸钠稀释的NT-3蛋白,封闭液1 M Ethanolamine-HCl pH 8.5封闭7 min,固定量为1288 RU。Fc1作为对照通道,活化封闭(图2)。
图1. NT-3预富集实验.
进样顺序依次是pH 5.5,pH 5.0,pH 4.5 10 mM醋酸钠稀释的20 μg/mL NT-3蛋白,之后是50 mM NaOH洗脱。
图2. NT-3固定.
A. Fc1-2活化;B. Fc2固定蛋白、封闭,Fc1封闭。
三、实验方法的建立
采用手动模式Run Sensorgram,选择Fc1-2通道,Fc1作为对照通道实时扣减获得Fc2-1信号。流速30 μL/min,分析物p75NTR或dg-p75NTR每个浓度一个cycle,每个cycle包括分析物进样2 min(KIJECT模式),解离200 s,随后5 mM NaOH再生20 μL,缓冲液进样30 μL,用于防止NaOH残留和等待基线稳定。观察实验信号,直至出现饱和趋势。最终采集了分析物p75NTR(25, 50, 100, 200, 400, 800 nM),dg-p75NTR(50, 100, 200, 400, 800, 1200, 2000, 4000 nM)与NT-3结合的信号,用于计算动力学和亲和力数据。
四、数据分析与数据解析
使用Biacore evaluation software 4.1对数据进行处理。一种处理方式是动力学分析,X-Transform将进样起始点调为0 秒,Y-axis Transform将每个浓度进样前基线调为0 RU。点击kinetics simultaneous ka/kd,选择合适的injection start和stop markers,以及用于拟合的association和dissociation阶段,拟合模型选择1:1 (Langmuir) binding model,输入每条曲线浓度,进行拟合。由于结合曲线形状接近平缓,还对数据进行了平衡态拟合。选择General获得进样结束前10 s的结合信号,以浓度为横坐标,选择steady state affinity model进行拟合。
实验注意要点
- Biacore实验所使用的p75NTR和dg-p75NTR蛋白质样品需要纯化到高纯度。
- 实验中对于蛋白质浓度的测定需要非常准确。
结果与数据分析
- 配体NT-3的偶联。预富集实验结果显示10 mM醋酸钠pH 5.5信号可以作为固定条件(图1)。NT-3固定量为1288 RU(图2)。
- 数据分析。
获得的结合曲线如图3A所示。由于p75NTR在800 nM时出现明显的饱和趋势,因此最高浓度做到800 nM。dg-p75NTR最高浓度做到4 μM。选择1:1 Langmuir binding model(图3B)和steady state affinity model(图3C)进行动力学和平衡态拟合。动力学拟合结果显示1,p75NTR与NT-3的亲和力32 nM,dg-p75NTR与NT-3的亲和力165 nM。平衡态拟合结果显示,p75NTR与NT-3的亲和力75 nM,dg-p75NTR与NT-3的亲和力418 nM。说明p75NTR失去糖基化修饰之后,与配体NT-3结合的能力下降。
2008年之前,NT-3和p75NTR之间的结合模式比例和作用机制尚不清楚,NGF与去糖基化p75NTR之间形成了一种不对称的2:1复合物的晶体结构被报道2。2008年,我们得到了NT-3和糖基化p75NTR之间形成的对称型2:2复合物和2.6埃分辨率的晶体结构1,而不是非对称型2:1。除了结合模式不同,我们也非常想了解dg-p75NTR与天然p75NTR与NT-3的亲和力是否有不同。Biacore实验成为了第一选择,Biacore实验结果证明了p75NTR失去糖基化修饰之后,与配体结合的能力会降低,它在NT-3激活p75NTR的功能中起重要作用。
图3. Biacore测定p75NTR和dg-p75NTR与NT-3的亲和力.
A. 原始结合曲线;B. 动力学拟合(1:1 Langmuir binding);C. 平衡态拟合(steady state affinity)。所用浓度梯度和计算出的亲和力如图所示。
致谢
我们感谢Genentech公司提供的重组人NT-3。该文章与我们之前发表在Nature (龚勇等,2008,DOI: 10.1038/nature07089)上的研究相关。
参考文献
- Gong, Y., Cao, P., Yu, H. J. and Jiang, T. (2008). Crystal structure of the neurotrophin-3 and p75NTR symmetrical complex. Nature 454(7205): 789-793.
- He, X. L. and Garcia, K. C. (2004). Structure of nerve growth factor complexed with the shared neurotrophin receptor p75. Science 304(5672): 870-875.
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Q&A
Copyright: © 2023 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:赵文聪, 陈媛媛, 龚勇, 曹鹏. (2023). Biacore技术检测神经营养因子NT-3与糖基化和去糖基化受体p75
NTR的亲和力.
Bio-101: e1011001. DOI:
10.21769/BioProtoc.1011001.
How to cite: Zhao, W. C., Chen, Y. Y., Gong, Y. and Cao, P. (2023). Application of Biacore Analysis to Measure the Affinity of Neurotrophin-3 with Glycosylated and Deglycosylated p75
NTR.
Bio-101: e1011001. DOI:
10.21769/BioProtoc.1011001.