Application of Biacore Analysis to Measure the Affinity of Neurotrophin-3 with Glycosylated and Deglycosylated p75^NTR   

材料与试剂

1. CM5芯片（Cytiva，BR100012）\
2. 氨基偶联试剂盒（Cytiva，BR-1000-50）
3. 10 mM醋酸钠 pH 5.0（Cytiva，BR100351）
4. 10 mM醋酸钠 pH 5.5（Cytiva，BR100352）
5. 10 mM醋酸钠 pH 4.5（Cytiva，BR100350）
6. 糖基化p75NTR胞外域蛋白和去糖基化p75^NTR（dg p75^NTR）胞外域蛋白，均为实验室表达纯化1，缓冲液为PBS。NT-3蛋白由Genentech公司赠送。
7. NaCl、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、HCl、NaOH为国药集团化学试剂有限公司产品，Tween 20为SIGMA-ALDRICH（货号为P1379-100ML）产品。
8. 其他耗材：1.5 mL EP管, 1 mL, 200 µL, 10 µL枪头均为Axygen公司产品。
9. 0.22 μm 微孔滤膜
   

仪器设备

1. Biacore 3000 (GE, Healthcare)
2. 超纯水仪（Millipore）
   

实验步骤

一、Biacore实验前准备

1. 运行缓冲液PBST的制备：溶解8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄和0.24 g KH2PO4在800 mL蒸馏水中，使用HCl调节pH值至7.4，加纯水和0.05 mL的Tween 20定容至1 L，使用前0.22 μm 微孔滤膜抽滤，取500 mL使用。
2. 0.5 M NaOH配置：称取2 g NaOH粉末，用100 mL纯水溶解，备用。5 mM NaOH，50 mM NaOH均用0.5 M NaOH稀释。
3. 停止Biacore 3000 standby状态，点击undock，将维护芯片更换为CM5芯片，放入500 mL运行缓冲液PBST，Prime。仪器实验温度维持25 ℃。
4. 氨基偶联试剂按照说明，EDC和NHS分别用10 mL纯水溶解，充分混匀后，分装至EP管，-20 ℃保存备用。

1. NT-3预富集实验。采用手动模式，点击Run Sensorgram，选择Fc3，输入flow rate 20 μL/min，进样选择inject模式，进样10 mM pH 5.5、pH 5.0和pH 4.5醋酸钠稀释的20 μg/mL NT-3蛋白，选择富集效果好的pH条件（图1）。
2. 配体偶联。Fc2选择作为固定通道，流速10 μL/min ，将EDC和NHS 1:1混匀作为活化剂，进样7 min, 随后注射6 μL pH 5.5醋酸钠稀释的NT-3蛋白，封闭液1 M Ethanolamine-HCl pH 8.5封闭7 min，固定量为1288 RU。Fc1作为对照通道，活化封闭（图2）。
   
   
   图1. NT-3预富集实验.
   进样顺序依次是pH 5.5，pH 5.0，pH 4.5 10 mM醋酸钠稀释的20 μg/mL NT-3蛋白，之后是50 mM NaOH洗脱。
   
   
   图2. NT-3固定.
   A. Fc1-2活化；B. Fc2固定蛋白、封闭，Fc1封闭。

三、实验方法的建立
采用手动模式Run Sensorgram，选择Fc1-2通道，Fc1作为对照通道实时扣减获得Fc2-1信号。流速30 μL/min，分析物p75^NTR或dg-p75^NTR每个浓度一个cycle，每个cycle包括分析物进样2 min（KIJECT模式），解离200 s，随后5 mM NaOH再生20 μL，缓冲液进样30 μL，用于防止NaOH残留和等待基线稳定。观察实验信号，直至出现饱和趋势。最终采集了分析物p75^NTR（25, 50, 100, 200, 400, 800 nM），dg-p75^NTR（50, 100, 200, 400, 800, 1200, 2000, 4000 nM）与NT-3结合的信号，用于计算动力学和亲和力数据。

四、数据分析与数据解析
使用Biacore evaluation software 4.1对数据进行处理。一种处理方式是动力学分析，X-Transform将进样起始点调为0 秒，Y-axis Transform将每个浓度进样前基线调为0 RU。点击kinetics simultaneous ka/kd，选择合适的injection start和stop markers，以及用于拟合的association和dissociation阶段，拟合模型选择1:1 (Langmuir) binding model，输入每条曲线浓度，进行拟合。由于结合曲线形状接近平缓，还对数据进行了平衡态拟合。选择General获得进样结束前10 s的结合信号，以浓度为横坐标，选择steady state affinity model进行拟合。

实验注意要点

1. Biacore实验所使用的p75^NTR和dg-p75^NTR蛋白质样品需要纯化到高纯度。
2. 实验中对于蛋白质浓度的测定需要非常准确。
   

结果与数据分析

1. 配体NT-3的偶联。预富集实验结果显示10 mM醋酸钠pH 5.5信号可以作为固定条件（图1）。NT-3固定量为1288 RU（图2）。
2. 数据分析。
   获得的结合曲线如图3A所示。由于p75NTR在800 nM时出现明显的饱和趋势，因此最高浓度做到800 nM。dg-p75NTR最高浓度做到4 μM。选择1:1 Langmuir binding model（图3B）和steady state affinity model（图3C）进行动力学和平衡态拟合。动力学拟合结果显示1，p75NTR与NT-3的亲和力32 nM，dg-p75NTR与NT-3的亲和力165 nM。平衡态拟合结果显示，p75NTR与NT-3的亲和力75 nM，dg-p75NTR与NT-3的亲和力418 nM。说明p75NTR失去糖基化修饰之后，与配体NT-3结合的能力下降。
   2008年之前，NT-3和p75NTR之间的结合模式比例和作用机制尚不清楚，NGF与去糖基化p75NTR之间形成了一种不对称的2:1复合物的晶体结构被报道2。2008年，我们得到了NT-3和糖基化p75NTR之间形成的对称型2:2复合物和2.6埃分辨率的晶体结构1，而不是非对称型2:1。除了结合模式不同，我们也非常想了解dg-p75NTR与天然p75NTR与NT-3的亲和力是否有不同。Biacore实验成为了第一选择，Biacore实验结果证明了p75NTR失去糖基化修饰之后，与配体结合的能力会降低，它在NT-3激活p75NTR的功能中起重要作用。
   
   
   图3. Biacore测定p75NTR和dg-p75NTR与NT-3的亲和力.
   A. 原始结合曲线；B. 动力学拟合（1:1 Langmuir binding）；C. 平衡态拟合（steady state affinity）。所用浓度梯度和计算出的亲和力如图所示。
   

致谢

我们感谢Genentech公司提供的重组人NT-3。该文章与我们之前发表在Nature (龚勇等，2008，DOI: 10.1038/nature07089)上的研究相关。

参考文献

1. Gong, Y., Cao, P., Yu, H. J. and Jiang, T. (2008). Crystal structure of the neurotrophin-3 and p75^NTR symmetrical complex. Nature 454(7205): 789-793.
2. He, X. L. and Garcia, K. C. (2004). Structure of nerve growth factor complexed with the shared neurotrophin receptor p75. Science 304(5672): 870-875.