Canine Somatic Cell Nuclear Transfer   

材料与试剂

1. 胚胎操作液（自配）
2. 细胞融合液（自配）
3. M199（Invitrogen）
4. FBS（Gibco）
5. 透明质酸酶（Sigma）
6. Ionomycin（Sigma）
7. 6-DMAP（Sigma）
8. 矿物油（Sigma）
9. 培养皿（Corning）
10. 口吸管（自制）
11. 玻璃针（国产）
    

仪器设备

1. 倒置显微镜（Olympus-IX73）
2. 显微操作系统（TransferMan 4r）
3. CO₂培养箱（Thermo-4111）
4. 生物安全柜（ESCO-AC2-6S1）
5. 体视显微镜（Nikon-SMZ745）
6. 电融合仪（BTX-ECM2001）
   

实验步骤

1. 确定犬卵母细胞成熟的时间并冲卵，收集体内成熟的卵母细胞；
2. 用0.1%的透明质酸酶脱去卵母细胞上的颗粒细胞；
3. 将脱去颗粒细胞的卵母细胞用Hoechst染色5 min；
4. 染色完成后清洗胚胎，并将胚胎转移到胚胎操作液中；
5. 在倒置显微镜下用固定针固定好卵母细胞，将极体置于3点钟方向；
6. 在荧光照射下可以看到细胞核，并用注射针吸去细胞核，第一极体及周边的胞质；
7. 用注射针吸取体细胞，并将体细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中；
8. 将重构好的胚胎用电融合液清洗两次，再移入电融合液中；
9. 调节好电融合参数（电压：4 kV/cm；时间：10 μs；脉冲数：2次），进行电融合；
10. 融合后的胚胎用胚胎培养液清洗3遍，转入胚胎培养基中，放入培养箱30 min；
11. 电融合后的胚胎再进行化学激活（10 μmol/L Ionomycin处理4 min；1.9 mmol/L 6-DMAP处理4 h）；
12. 激活后用胚胎培养基清洗3遍，放入培养箱中培养，待移植。
    

结果与分析

1. 重构胚胎的融合率低，可能与卵母细胞的成熟程度或是融合的条件和参数有关；
2. 体细胞克隆效率低，可能与体细胞的类型和整个克隆操作效率有关。
   

失败经验

1. 细胞融合过程中需要将胚胎摆好，让体细胞的位置与电流方向垂直；
2. 细胞电融合过程中可以适当提高电压或是换用点状电极。
   

溶液配方

1. 胚胎操作液
   M199+10%FBS
2. 胚胎培养液（SOF）
   3%(v/v) EAA + 1%(v/v) NEAA + BSA (3 g/L) + Hepes (10 mM) + NaCl (63.35 mg/ml) + KCl (5.35 mg/ml) + KH₂PO₄ (1.6 mg/ml) + MgCl·6H₂O (1.8 mg/ml) + NaHCO₃ (21 mg/ml) + CaCl·2H₂O (26.2 mg/ml) + L-Glu (29.2 mg/ml) + 1% P/S(v/v) + 肌醇 (0.5 mg/ml) + 丙酮酸钠 (0.2 mM) + 0.6%乳酸钠(v/v)
3. 电融合液
   0.26 M mannitol + 0.1 mM MgSO4 + 0.5 mM Hepes + 0.05%(w/v) BSA
   

致谢

1. 感谢北京希诺谷生物科技有限公司提供的实验场地、实验用犬及技术研发；
2. 研究成果以“Generation of ApoE deficient dogs via combination of embryo injection of CRISPR/Cas9 with somatic cell nuclear transfer”发表在Journal of Genetics and Genomics杂志上。
   

参考文献

1. 胡敏华，周志东, 王晓民 , 龙海斌 , 倪庆纯 , 刘运忠. (2015) 实验用Beagle犬的繁殖性能分析. 广东畜牧兽医科技, 3: 41-44.
2. 张敦伟, 王晓民, 连雪科, 刘运忠, 高 翔, 倪庆纯. (2013) Beagle犬活体取胎及其成纤维细胞的培养. 实验动物与比较医学, 3: 210-214.
3. Bouchard, G. F., Solorzano, N., Concannon, P. W., Youngquist, R. S., Bierschwal, C. J. (1991) Determination of ovulation time in bitches based on teasing, vaginal cytology, and elisa for progesterone. Theriogenology 3: 603-11.
4. Feng, C., Wang, X. M., Shi, H., Yan, Q. M., Zheng, M., Li, J., Zhang, Q. J., Qin, Y. M., Zhong, Y. G., Mi, J. D., Lai, L. X. (2018). Generation of ApoE deficient dogs via combination of embryo injection of CRISPR/Cas9 with somatic cell nuclear transfer. J Genet Genomics 45: 47-50.
5. Concannon, P. W. (1986). Canine pregnancy and parturition. Vet Clin North Am Small Anim Pract 16: 453-75.
6. Evans, J. M., and Savage, T. J. (1970) The collection of vaginal smears from bitches. The Veterinary record 87: 598-599.
7. Jang, G., Kim, M. K., Oh, H. J., Hossein, M. S., Fibrianto, Y. H., Hong, S. G., Park, J. E., Kim, J. J., Kim, H. J., Kang, S. K., Kim, D. Y., Lee, B. C. (2007) Birth of viable female dogs produced by somatic cell nuclear transfer. Theriogenology 5: 941-7.
8. Zou, Q. J., Wang, X. M., Liu, Y. Z., Ouyang, Z., Long, H. B., Wei, S., Xin, J. G., Zhao, B. T., Lai, S. S., Shen, J., Ni, Q. C., Yang, H. Q., Zhong, H. L., Li, L., Hu, M. H., Zhang, Q. J., Zhou, Z. D., He, J. X., Yan, Q. M., Fan, N. N., Zhao, Y., Liu, Z. M., Guo, L., Huang, J., Zhang, G. G., Ying, J., Lai, L. X., Gao, X. (2015). Generation of gene-target dogs using CRISPR/Cas9 system. J Mol Cell Biol 6: 580-3.