Allotransplantation of Chicken Embryo   

材料与试剂

1. 试验用苏禽96种蛋由江苏省家禽研究所提供，孵化条件为：36.10 °C ~38.3 °C；相对湿度为50%~65%；每3 h转蛋1次
2. 医用生理盐水
3. 石蜡（Sigma, catalog number: 25322-68-3）
4. 青霉素（Sigma, catalog number: P3032）
5. 链霉素（Sigma, catalog number: P4333）
   

仪器设备

1. 镊子
2. 孵化箱（无锡设备厂，型号：鸣凤4820型）
   

实验步骤

一、代用蛋壳培养
试验分组

1. 第 1组：将比普通蛋大，重量约80~100 g的新生双黄鸡蛋，在其钝端用眼科镊子去蛋壳，切口直径约4 cm，用 0.85%的生理盐水冲洗 2次备用。新鲜的受精蛋，用 75%的酒精全面消毒，在鸡蛋钝端轻轻打开一直径约3 cm的开口，用肉眼观察鸡胚盘是否受精，若是受精胚盘 ,则将胚盘连同蛋清一并转入双黄蛋代用蛋壳内，分别为：① 0.5 ml生理盐水；② 1.0 ml生理盐水；③ 蛋清；④ 不加任何物质。4个小组均加入双抗各 5,000 IU。小心除去气泡后用保鲜膜封口，石蜡固定，钝端向上放入孵化箱中± 45°角度转蛋孵化,转蛋间隔3 h[2]。
2. 试验方法与第 1组相同，区别是第2组代用蛋壳是普通新生蛋蛋壳。但内容物为等量移植，其中转蛋角度为± 30°的设为⑤组，转蛋角度为± 45°的设为⑥组，比较不同转蛋角度对鸡胚发育的影响。
3. 对照组 I：将实验种蛋用75% 酒精表面消毒之后，10只直接入孵化箱中以± 45°转蛋角度孵化 ,比较代用蛋壳和正常孵化情况下鸡胚发育的情况。
   对照组II：20枚判断为受精蛋，但不进行换壳处理的种蛋，经去壳、保鲜膜封口，分别以± 30°( 10枚)和± 45°( 10枚)转蛋角度，入孵，分别作为⑤组、⑥组的对照。
   对照组III：在孵化不同时期 ,比较代用蛋壳和正常蛋孵化期胚胎重量及喙长和第三趾长，分析试验组与对照组是否存在差异。

1. 试验用种蛋分 4批消毒之后，在钝端开一小孔；
2. 顺小孔逐渐去掉蛋壳以及蛋壳膜，形成直径为2 cm的圆口；
3. 无菌玻璃吸管（直径约0.8 cm）吸出供体胚盘；
4. 移植入另一已吸去胚盘的受体种蛋的蛋黄之中；
5. 注入青、链霉素各5,000 IU；
6. 保鲜膜封口；
7. 以±30°和 45°角度入孵；
8. 观察胚盘移入异体营养系统时每天的发育情况，以上所有操作均在无菌条件下进行。
   注：代用蛋壳鸡胚孵化至 16 d时在保鲜膜上打一个小孔，至 19 d开始用肺呼吸时，孔的开口增大一些，在出雏前几个小时去掉保鲜膜。

结果与分析

1. 整胚移植结果分析
   双黄蛋代用蛋壳试验中，以±45°角度进行孵化，第5 d观察时存活率:①、②、③、④组分别为40%、25%、30.8%、58.3%，不加任何物质的④组比其它3个组显著(P<0.05)的高，而且④组有8.3%孵化出小鸡。其它组均在第7天或第9天夭亡。说明大蛋壳作为代用壳，不需要添加生理盐水和卵白。
   普通蛋代用蛋壳试验中，⑤、⑥组分别以±45°和±30°转蛋角度孵化移植的整胚，第5天照蛋时，存活率±45°组显著(P<0.05)高于±30°组，分别为64.7%和36.4%。转蛋角度为±30°的试验组(⑤组)鸡胚仅发育至第6天，其中第5天的存活率为36.4%，第6天时为4.5%，第7天为0。而转蛋角度为±45°的试验组(⑥组)中的鸡胚发育前5 d的存活率为64.7%，第12天时下降为2.9%，第13天为0，时间最长可至12 d。⑤组对照组Ⅱ-5的鸡能孵化至第7天，前5 d其存活率为60%，第6天仍为50%，到第7天时下降为30%，第8天时则为0。而⑥组对照组Ⅱ-6中的鸡胚可发育至11 d，前7 d的孵化存活率为50%，至11 d时下降为30%，12 d时则下降为0，说明转蛋角度幅度大比转蛋角度小有利于鸡胚胎生长。不经任何处理的对照Ⅰ以±45°孵化时，获得了90%的出雏率。第1组的双黄蛋代用壳第6天胚胎发育率(平均21.1%)比第2组±45°转蛋角度(6组)的普通蛋代用壳的胚胎发育率(48.5%)显著(P<0.05)低。但是双黄蛋代用蛋壳的孵化率(8.3%)显著高于普通蛋代用蛋壳。普通蛋代用壳无小鸡孵出，说明普通蛋壳对移植等量鸡胚后期的发育空间不够，这一原因有待进一步研究。
   
   表1. 鸡胚代用蛋壳整胚移植孵化的存活率
   

   组别	移植数（n）	孵化天数
   		4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	…	21
   ①	10	70	40	10	0
   ②	12	50	25	8.3	0
   ③	13	84.6	30.8	7.7	7.7	7.7	0
   ④	12	83.3	58.3	58.3	33.3	16.7	16.7	…	…	…	…	…	8.3
   对照组I±45°	10	90	90	90	90	…	…	…	…	…	…	…	90
   实验组I±30°	68	45.5	36.4	4.5	0
   对照组II⑤	10	80	60	50	30	0
   实验组II±45°	84	67.6	64.7	48.5	44.1	33.8	13.2	7.4	5.9	2.9
   对照组II⑥	10	80	50	50	50	30	30	30	30	0	0

   
   
   
2. 移植鸡胚胎发育体尺变化情况
   从表 2可见，以物理指数体重、第三趾长和喙长为参数，代用蛋壳孵化鸡胚胎生长发育比正常孵化鸡胚生长发育有迟缓的趋势。除第三趾长外，对照组和试验组的胚重在10 d之前无显著差异。在孵化10 d以后，差异显著。喙长虽然两组之间差异不显著，但从生长发育测量值的趋势可看到，试验组仍比对照组生长稍迟缓。可能是在第7～9天由于移植胚胎与代用蛋壳相互识别和适应的过程以及水分丢失造成以后的发育迟缓。此时实验观察到，卵黄囊出现部分或整个的萎缩。胚胎发育迟缓或夭亡，其原因比较复杂，有温度、湿度、气体交换、水分的保持等因素，影响代用壳鸡胚的发育。因为代用蛋壳无气室、钝端有一部分蛋壳被保鲜膜代替，可能对气体交换、水分交换均有影响。
   
   表2. 移植鸡胚胎发育的体尺变化
   

   胚龄	样本数	体重（g）			喙长（mm）			第三趾长（mm）
   		对照组	代用蛋壳组	对照组		代用蛋壳组	对照组		代用蛋壳组
   4	10	0.10±0.01	0.08±0.01
   5	10	0.20±0.04	0.18±0.36
   6	10	0.53±0.09	0.50±0.09
   7	8	0.81±0.01	0.74±0.01
   8	8	1.20±0.13	1.01±0.09	3.75±0.75
   9	5	1.88±0.36	1.61±0.31	2.83±0.21		2.01±0.13
   10	5	2.70±0.23	2.50±0.22*	4.37±0.49		4.35±0.16	5.30±0.11
   11	3	3.81±0.43	3.40±0.40*	9.70±2.95		9.68±0.43	7.30±1.16
   12	3	6.67±0.75	5.12±0.70*	10.33±1.53		10.01±0.55	8.40±1.21		8.20±1.01
   13	3	9.35±0.32	8.76±0.30*	10.20±1.12		10.31±0.17	10.10±2.13		10.70±1.12

   注：*代表同一天内对照组与试验组差异显著。
   
   
3. 异体胚盘的移植结果分析
   由表3可见，异体胚盘移植时，其孵化存活率很低。第5天的存活率为37. 5% (30/80)；第 7天的存活率为6.25% (5/80)，至第8天则为0。胚胎在转角为±45°时，第 5天的存活率在37. 5%，以后突然下降，其原因可能是第 5~7天是胚胎通过卵黄循环吸收营养和大量水分的转换时期 ,由于异体移植胚胎时，破坏了胚胎与卵黄之间本来完好的联系，造成营养和水分供应不足而夭亡。
   
   表3. 异体胚盘移植孵化存活率
   

   批次	重复（n）	孵化天数与发育数
   		5	6	7	8
   第一批	20	6	2	1	0
   第二批	20	8	3	2	0
   第一批	20	7	3	1	0
   第二批	20	9	2	1	0

致谢

我们在此感谢李碧春，赵东伟，陈国宏，王克华，钱菊汾等人的前期研究工作。

参考文献

1. Sanders, E. J., Parker, E., Arámburo, C. and Harvey, S. (2005). Retinal growth hormone is an anti-apoptotic factor in embryonic retinal ganglion cell differentiation. Experimental Eye Research 81(5): 551-560.
2. Perry, M. M. (1988). A complete culture system for the chick embryo. Nature 331(6151): 70-72.
3. Naito, M., Nirasawa, K. and Oishi, T. (1990). Development in culture of the chick embryo from fertilized ovum to hatching. J Exp Zool 254(3): 322-326.