In Vitro Fertilization of Mouse   

材料与试剂

材料

1. 培养皿35mm×10mm（Corning，货号：430588）
2. 胚胎移植口吸管（北京吉田生物科技有限公司，规格：1.0×500mm）
3. 吸头（Axygen，货号：T-300-R-S、T-1000-B-R-S、T-200-Y-R-S）
4. 无菌注射器（上海米沙瓦医科工业有限公司，规格：1mL）
5. 50mL离心管（BD，货号：352070）
6. 滤纸（宝威德，规格：60 × 60 cm）

动物：3-6月龄成年雄鼠，1-2只/品系。4-5周龄雌性供体小鼠，4-5只/品系（根据雄性小鼠背景品系选用)。本实验室所用动物来自杭州师范大学实验动物中心（生产许可证号：SCXK（浙）2016-0004，使用许可证号：SYXK（浙）2016-0014），饲养在独立换气笼盒系统，动物自由饮水、自由采食经Co⁶⁰辐射的灭菌饲料。

试剂

1. 注射用血促性素（PMSG, Pregnant Mare Serum Gonadotropin）(宁波市三生药业有限公司, 规格:1000IU×10瓶)和注射用绒促性素（hCG, human Chorionic Gonadotropin,）(宁波市三生药业有限公司, 规格:1000IU×10支)
2. 矿物油（Sigma，货号：M8410）
3. mHTF：按表1配制。
4. mHTF-GSH：按表2配制。
5. TYH with MβCD（TYH with Methyl-β-cyclodextrin）按表3配制。

仪器设备

1. 100mL烧杯（蜀牛，货号：GG-17）
2. 100mL容量瓶（天玻，货号：TB9）
3. 生物安全柜（Thermo Scientific，型号：1384 ）
4. 超净工作台（苏净安泰，型号：HS-840-U）
5. CO₂培养箱（Thermo Scientific，型号：3111 ）
6. 体视显微镜（Nikon，型号： SMZ745T）
7. 电子天平（Sartorius，型号：MSA125P-CE）
8. 电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，型号：DK-S22型）
9. 微量移液器 （eppendorf，货号：3120000224、3120000240）
10. 手术剪（上海金钟，型号：J21010）
11. 医用镊（上海金钟，型号：J40120）
12. 维纳斯剪（上海金钟，型号：YC0040）
13. 显微镊（上海金钟，型号：WA3030）
14. 眼科直剪（上海金钟，型号：Y00030）
15. 眼科直镊（上海金钟，型号：JD1050）
    

实验步骤

一、准备工作

1. 超数排卵：供体小鼠腹腔注射PMSG，每只5IU（0.1mL）。46-48h后，腹腔注射hCG，每只5IU（0.1mL）。
2. 精子获能滴（TYH with MβCD，如图1-A）：用TYH with MβCD液在培养皿内做一个100µL液滴（冻存精液滴为90µL），加3-4mL矿物油覆盖，在培养箱（37℃、5%CO₂）孵育至少30min。
3. 受精滴（mHTF-GSH，如图1-B）：用mHTF-GSH液在培养皿内做两个200µL液滴（冻存精液滴为90µL），加3-4mL矿物油覆盖，在培养箱（37℃、5%CO₂）孵育至少10min。
4. 清洗滴（mHTF，如图1-C）：用mHTF液在培养皿内做3个80µL液滴和1个160µL液滴，加3-4mL矿物油覆盖，在培养箱（37℃、5%CO₂）孵育至少30min。
5. 水浴准备：恒温水浴锅开启37℃水浴。
   
   
   图1. 小鼠体外受精实验培养滴 A. 精子获能滴（TYH with MβCD） B. 受精滴（mHTF-GSH） C. 清洗滴（mHTF），胚胎按照图中白色箭头方向清洗转移

1. 精子的采集及获能
2. 卵母细胞采集（如图2-D,E,F）：将注射hCG的供体小鼠（15-17h后）断颈处死，酒精消毒。剪开背部皮肤，快速找到输卵管，在滤纸上吸干，放入受精滴培养皿的矿物油中。在显微镜下找到膨大部，牵引卵丘团流出，并将其拖入mHTF-GSH滴中（取至4-6簇卵丘团）。注意：为保证质量，在处死动物到卵丘团放入液滴的过程中，务必在30sec内完成。
3. 体外受精（如图2-G,H）：精液孵育50-60min后，观察精子活力，并沿着TYH with MβCD滴的外围用移液器吸取4-5µL精液（冷冻复苏精液可根据精子活力及浓度增加量至10-20µL），放入含有卵母细胞的mHTF-GSH滴中，并将其放入培养箱（37℃、5%CO₂）培养3h。
4. 清洗：受精后培养3h，将细胞先转入80µL的mHTF滴中，3次清洗后，转入160µL的mHTF滴培养6h，去除未受精的卵母细胞和含有单原核的孤雌生殖卵母细胞，保留含有第二极体和两个原核的受精卵细胞（如图2-I,J）。
5. 受精卵过夜培养：次日挑选发育正常的2-细胞（如图2-K），用胚胎移植口吸管转移至mHTF的第4个滴中，移植或者胚胎冻存备用。同时记录2-细胞、单细胞和异型细胞的数量，计算受精率。
   
   
   图2. 小鼠体外受精过程. A. 附睾的解剖位置 A-1. 附睾组织结构图 B. 取出的附睾尾 C. 冷冻精子复苏精液 D. 输卵管解剖位置 E. 输卵管壶腹部 F.卵母细胞-卵丘团 G. 获能完成的精子悬液 H. 受精 I、J. 受精6小时后细胞形态 K. 受精24小时后细胞形态

溶液配方

1. mHTF配制表
2. mHTF-GSH配制表
3. TYH with MβCD配制表
   
   表1：mHTF配制表（100mL体积）
   

   名称	重量（mg）	品牌	货号
   NaCl	593.8	Sigma	S-5886
   KCl	35.0	Sigma	P-5405
   CaCl2	57.0	Sigma	G-5670
   Glucose	50.0	Sigma	G-6152
   MgSO4	2.4	Sigma	M2643
   KH2PO4	5.4	Sigma	P-5655
   Sodium pyruvate	3.5	Sigma	P-4562
   60%sodium lacate	0.34mL	Sigma	L-7900
   NaHCO3	210.0	Sigma	S-5761
   Penicillin G	7.5	BD	C15935000
   Streptomycin	5.0	Sigma	S-1277
   Bovine serum albumin	400.0	Sigma	B2064
   0.5%phenol red	0.04ml	Sigma	P-0290

   
   配制方法：在100mL的烧杯中，加入80mL的灭菌水(Sigma,W1503)，将上述药品依次加入混匀，容量瓶定容至100mL。0.22µM针式过滤器过滤分装在1.5mL的离心管内。4℃保存可用30天。
   
   表2：mHTF-GSH配制（1mL体积）
   

   名称	重量（mg）	品牌	货号
   GSH	1.5	Sigma	G4251
   mHTF	1（mL）	-	无

   
   注：“-” 为混合试剂，配方参见表1
   配制方法：称取1.5mg(冷冻精液取3.1mg)的GSH，溶解在装有mHTF(1mL)的1.5mL离心管内，再分次将100µL上述溶液转移至装有mHTF（900µL）的1.5mL离心管内，混匀密封，-20℃冷冻保存备用，有效期约30天。
   
   表3：TYH with MβCD配制（100mL体积）
   

   名称	重量（mg）	品牌	货号
   NaCl	697.6	Sigma	S-5886
   KCl	35.6	Sigma	P-5405
   CaCl2.2H2O	25.1	Sigma	G-5670
   Glucose	100.0	Sigma	G-6152
   MgSO4	14.3	Sigma	M2643
   KH2PO4	16.2	Sigma	P-5655
   Sodium pyruvate	5.5	Sigma	P-4562
   Polyvinyl alcohol	100.0	Sigma	P-8136
   Penicillin G	7.5	BD	C15935000
   Streptomycin	5.0	Sigma	S-1277
   Methyl-β-cyclodextrin	98.3	Sigma	C-4555
   NaHCO3	210.6	Sigma	S-5761

   
   配制方法：在100mL烧杯中加入70mL的灭菌水（Sigma,W1503），将上述药品依次加入，混匀；同时，100mg（Polyvinyl alcohol）放入含有10mL灭菌水的离心管中，60℃水浴10min，溶解后加入烧杯中，再依次加入其它试剂溶解，最后定容至100mL。0.22µM针式过滤器过滤分装在1.5mL的离心管内。4℃保存可用30天。
   PMSG配制方法：将1000IU /支的PMSG稀释在20mL灭菌水中，制成50IU/mL的备用液。-20℃冷冻保存可使用14天。
   hCG配制方法：将1000IU/支的hCG稀释在20mL灭菌水中，制成50IU/mL的备用液。-20℃冷冻保存可使用14天。
   

经验体会

1. 供体小鼠年龄的要求，常用4-5周龄背景品系雌鼠，超排效果较好，获取的卵母细胞数量较多。6-8周龄小鼠的超排效果相对较差。8周龄以上的雌鼠，在超排时，根据体重适当加大超排剂量，超排效果尚可。
2. 体外受精对雄鼠的要求不高，健康雄鼠精液质量较好，受精率较高一般均能达到90%上。若雄鼠年龄偏大，精液质量欠佳，受精率会相对较低一般在50-80%左右。个别品系及个体差异出现过30%左右的受精率。可根据雄鼠状态相应准备足够数量的供体雌鼠。
3. 卵母细胞的采集，尽可能在小鼠断颈后30sec内完成，如果无人配合，可单只处死快速采集，可减少异形细胞或孤雌生殖卵母细胞的出现。
4. 体外受精时精液的用量一般为3-5μL，可根据精液的浓度和精子活力适当调整加液量。冷冻复苏时精液应加倍。
5. 在受精后6h，可观察到含有第二极体和两个原核的受精卵细胞，同时含有单原核的孤雌生殖卵母细胞，这种细胞需剔除。
6. 移卵针的挑选。如果是自行制作的，应保证移卵针前端圆润，以免伤到细胞，同时应注意孔径大小，若过大，在吸放卵细胞时不好控制，导致清洗不干净；若过小，有可能会损伤细胞，吸放比较费力。目前有商品化的移卵针，可根据情况自行选用。
7. 在TYH with MβCD配制过程中，因聚乙烯醇可溶性不好，需要先溶于水，涡旋混匀，在60℃水浴锅内温浴10min，之后再加入总的液体中。
8. 加入还原性谷胱甘肽的HTF作为受精液，可有效提高受精率，尤其对冷冻复苏精子尤为明显。
   

致谢

本实验方法源自日本熊本大学动物资源与开发中心。撰稿人顾美儿曾经得到Naomi Nakagata教授和Toru Takeo博士的大力帮助，尤其在实验技术要点及操作细节方面得到悉心指导，杭州师范大学实验动物中心及中科院分子细胞中心动物实验技术平台及在多年实践中全面掌握并成功应用了此技术方法。

参考文献

1. Takeo, T. and Nakagata, N. (2011). Reduced glutathione enhances fertility of frozen/thawed C57BL/6 mouse sperm after exposure to methyl-beta-cyclodextrin. Biol Reprod 85(5): 1066-1072.
2. Takeo, T., Sztein, J. and Nakagata, N. (2019). The CARD Method for Mouse Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization Using Frozen-Thawed Sperm. Methods Mol Biol 1874: 243-256.
3. Guan, M., Bogani, D., Marschall, S., Raspa, M., Takeo, T., Nakagata, N. and Fray, M. (2014). In vitro fertilization in mice using the MBCD-GSH protocol. Curr Protoc Mouse Biol 4(2): 67-83.
4. Nakagata, N., Takeo, T., Fukumoto, K., Haruguchi, Y., Kondo, T., Takeshita, Y., Nakamuta, Y., Umeno, T. and Tsuchiyama, S. (2014). Rescue in vitro fertilization method for legacy stock of frozen mouse sperm. J Reprod Dev 60(2): 168-171.
5. Takeo, T. and Nakagata, N. (2010). Combination medium of cryoprotective agents containing L-glutamine and methyl-{beta}-cyclodextrin in a preincubation medium yields a high fertilization rate for cryopreserved C57BL/6J mouse sperm. Lab Anim 44(2): 132-137.
6. Takeo, T., Hoshii, T., Kondo, Y., Toyodome, H., Arima, H., Yamamura, K., Irie, T. and Nakagata, N. (2008). Methyl-beta-cyclodextrin improves fertilizing ability of C57BL/6 mouse sperm after freezing and thawing by facilitating cholesterol efflux from the cells. Biol Reprod 78(3): 546-551.