Transplantation of Spermatogenic Stem Cells of Tree Shrew   

材料与试剂

1. 树鼩
   1岁龄雄性，购买于中国科学院昆明动物研究所灵长类中心。经白消安给药后1个月进行移植。
   
2. 试剂耗材
   
   

仪器设备

实验步骤

1. 移植前准备
   a)

   准备手术器械，包括手术镊子、剪刀等，121 ℃高压灭菌20 min，烘干备用；
   b)

   准备毛细玻璃管（内径0.9 mm，外径1.1 mm），用拉针仪拉制成尖端内径为50-80 μm的注射针，拉3-5根，备用；
   c)

   注射装置准备：准备硅胶管（内径1 mm，外径3 mm），一端连上10 ml注射器，另一端连上拉制好的毛细管玻璃针，备用。
2. 精原干细胞准备
   a)

   将培养的转基因精原干细胞（P15-P30）重悬至15 ml离心管，用细胞计数器计数；
   b)

   1000 rpm离心5 min，弃去培养基上清；
   c)

   将细胞沉淀用PBS重悬，浓度约1×10⁴ cells/μl，每只受体树鼩准备100 μl细胞悬液，置于37 ℃细胞培养箱备用。
3. 精原干细胞移植
   a)

   树鼩麻醉：将树鼩装到透气的布袋中，称体重，用200 mg/kg剂量的氯胺酮，通过肌肉注射的方式对树鼩进行麻醉；
   b)

   将麻醉后的树鼩置于手术垫上，平卧，展开四肢并固定；
   c)

   备皮：由于树鼩的睾丸会在阴囊和腹腔间滑动，因此手术前需观察树鼩睾丸是否在阴囊中，如果没有，可用手轻轻往阴囊的方向推按其腹部，使睾丸归位到阴囊中。将树鼩阴囊外皮部分的毛发用剪刀去除，用碘伏消毒；
   d)

   用剪刀将阴囊皮肤剪开，在阴囊附近放一张用生理盐水湿润的滤纸，将睾丸和附睾轻轻拽出，放到滤纸上；
   e)

   在解剖镜下观察树鼩的睾丸，树鼩的输出小管位于睾丸与附睾的连接处的血管和脂肪间，用镊子将输出小管旁边的脂肪和血管拨开(图1)；
   f)

   向准备好的PBS细胞悬液中加入0.04%的台盼蓝，轻轻混匀。用前面制作好的注射装置，吸取50 μl转基因精原干细胞悬液；
   g)

   左手持镊子将树鼩睾丸输出管拉直，右手持装载细胞悬液的注射针，在解剖镜下将注射针尽量平行地推入输出管，在针尖接近输出管与睾丸网的接口时停止。操作人员保持不动，请另一协助人员轻轻推动注射器，将细胞注射入睾丸曲细精管中；
   h)

   保持镜下实时观察，如果注射成功，可看到睾丸中的曲细精管变蓝 (图2)，当70%以上的睾丸被混有台盼蓝的细胞悬液充盈时，可以停止注射，轻轻拔出注射针；
   i)

   用相同的方法，对另一侧睾丸进行细胞移植；
   j)

   将移植后的睾丸放回阴囊，对阴囊外皮进行缝合，用碘伏消毒；
   k)

   术后的动物置于保暖垫上至有苏醒迹象，放回饲养笼，每天观察术后情况；
   l)

   移植术后2个月左右，可使受体树鼩与雌性树鼩交配繁殖，对子代进行基因型鉴定。
   
   
   图1.树鼩睾丸解剖及精原干细胞移植示意图
   
   

结果与分析

在注射细胞时，可以看到混有台盼蓝的溶液沿着曲细精管快速充盈睾丸(图2)。如果注射失败，蓝色液体不会如图2中这样呈管状分布，而是会将整个睾丸变蓝。


图2. 以0.04%台盼蓝作为指示剂将精原干细胞移植入受体树鼩睾丸曲细精管中

经验总结

1. 台盼蓝有一定毒性，因此在即将注射细胞的时候再混入台盼蓝，以免过早加入影响细胞活性。如果觉得颜色比较浅不容易观察，可将台盼蓝浓度提高一些（0.04%-0.1%）;
2. 树鼩的输出管离血管很近，因此操作不当容易引起大出血，应在正式注射前，多加练习。
   

溶液配方

无需现配溶液

致谢

1. 相关工作得到了中国科学院 (XDB13000000 和XDA01010203)、云南省 (2015HA038)、NSFC-云南联合基金项目 (U1702284)以及昆明动物所“135”项目资助。
2. 利用本研究相似的方案，我们建立了GFP转基因树鼩，相关工作于2017年发表于《Cell Research》(Li et al., 2017)。
3. 前期严兰珍、赵旭东等建立了由输出管向树鼩睾丸曲细精管内移植的技术体系，为本实验方案提供了参考。
   

参考文献

1. Li C.H., Yan L.Z., Ban W.Z., Tu Q., Wu Y., Wang L., et al. (2017). Long-term propagation of tree shrew spermatogonial stem cells in culture and successful generation of transgenic offspring. Cell Res 27: 241-252.