材料与试剂
- 医用缝合线(上海浦东金环医疗用品股份有限公司,catalog number: 11U0907)
- 麻醉剂Avertin(sigma–Aldrich, catalog number: T4,840-2)
- 人绒毛膜促性腺激素(hCG)(宁波第二激素厂, catalog number: 140322)
- 孕马血清促性腺激素(PMSG)(宁波第二激素厂, catalog number: 140324)
- 矿物油(sigma–Aldrich, catalog number: M8410)
- M2培养(sigma–Aldrich, catalog number: M7167)
- DMSO(sigma–Aldrich, catalog number: D2650)
- 1 M DMSO(自行配制,参见参考文献)
- 冻存液DAP213(自行配制,参见参考文献)
- DPBS缓冲液(GIBCO, catalog number: C14190500BT)
- KSOM (Merck Millipore, catalog number: MR-107-D)
- sucrose (Merck Millipore, catalog number: 1.00892.9050)
仪器设备
- CO2培养箱(Thermo, Herocell 180)
- 手术器械购置上海医疗器械(集团)有限公司,手术剪(Y00030, 10cm直尖头),解剖剪(JD1050,10cm,直有钩),眼科镊(JD1070,10cm直有钩),显微镊(WA3210),显微剪(WA1030)
- 体视显微镜(Motic SN-168)
实验步骤
- 超数排卵与合笼交配
取6周龄雌性长爪沙鼠,每只动物腹腔注射PMSG 10 IU,70小时后腹腔注射hCG 10 IU,之后与10周龄以上雄性长爪沙鼠合笼(图1),使用露底的笼盒以便检查阴道栓。
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图1. 检查阴道栓使用的露底笼盒
合笼第二天在检查到阴道栓(长爪沙鼠阴道栓呈乳白色,外形及大小类似大米,但两端稍尖),之后将雌性动物与雄性动物分开饲养,第三天早上对雌性长爪沙鼠实施安死术,使用DPBS溶液冲出输卵管伞部2-cell胚胎,进行胚胎冻存。
- 2-cell期胚胎冷冻试剂准备:(根据胚胎数量,决定使用每种试剂的量)
①DMSO(常温),DAP213A,DAP213B冰上预冷1小时以上。
②实验过程使用的EP管需要冰上预冷;冻存管常温。
③DAP213(DAPA:DAPB=1:1)使用前配制混匀。
④在冻存管标记品系信息(一定清晰准确,以防品系混淆)。
- 洗卵和冻存:
在培养皿中做四个1M的DMSO液滴(100 μL/液滴),其中一个液滴用于清洗胚胎,其他的液滴则用于放置清洗后准备冷冻的胚胎。用口吸管将一组胚胎移入其中的一个液滴内,以清洗其培养液或胚胎采集溶液等,然后均匀分配胚胎至另外三个液滴中。例如,采集了150个胚胎,先将其移入一个DMSO液滴中,然后按照每组50个分别移入另外三个液滴中。用移液器调整移液量至5μL后吸取50枚胚胎,移入冷冻管内,然后将冷冻管放入冰上,在0℃状态平衡5分钟后,加入预先放置在0℃冰上平衡的DAP213溶液45μL,盖子拧紧后回拧半圈,在冰上再平衡5分钟,取出平衡后的冷冻管,迅速装入冷冻管固定夹后,直接浸入液氮中。
- 胚胎复苏
准备预热的KSOM培养滴,80 μL/滴。
从液氮中取出冻存管,倒掉液氮,室温放置30 s,加入900 μL sucrose,轻轻吹打10次左右,吸出试剂和胚胎;再吸取剩余的sucrose加入冻存管,吸出遗漏的胚胎。
致谢
感谢国家自然科学基金项目(Nos. 31572341, 31572347, 31772545, 31572348)、国家科技支撑计划项目(No.2015BAI09B00)和和“十三五”时期北京市属高校高水平教师队伍建设支持计划(IDHT20170516)的资助。
参考文献
- 郭红刚, 卢领群, 周生来, 戴方伟, 李巍, 李长龙, 陈振文, 萨晓婴(2014). 乙二醇玻璃化冷冻液二步法对长爪沙鼠2-细胞胚胎的冷冻保存. 实验动物科学 31: 28~31,64~65
- 梁洋,杜文敬,王春生,朴善花,安铁洙(2010). 小鼠早期胚胎的EFS20/40、EFS40、DAP213和GP25玻璃化法冷冻保存. 江西农业大学学报 32(06): 1248~1252
引用格式:李长龙, 张静, 郭红刚, 郭萌, 刘世景, 侯金莲, 朱艳敏, 吕珊, 杜小燕, 常在, 陈振文. (2021). 长爪沙鼠胚胎冷冻保存与复苏. // 实验动物胚胎操作实验手册.
Bio-101: e1010928. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010928.
How to cite: Li, C. L., Zhang, J., Guo, H., G., Guo, M., Lui, S. J. Hou, J., L, Zhu, Y., M., Lv, S., Du, X., Y., Chang, Z., and Chen, Z., W. (2021). Embryo Cryopreservation and Recovery in Mongolian Gerbils. // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals.
Bio-101: e1010928. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010928.