材料与试剂
- 麦管（Planer, catalog number: FCBS010287）
- EP管（Eppendorf）
- 矿物油（sigma, catalog number: M8410）
- 精子冻存液（CPA, catalog number: KYD-001-EX）
- HTF（CPA, catalog number: R18S3）
仪器设备
- 35 mm培养皿(Nunc-153066)
- 计时器（kubler）
- 浮漂（自行制备）
- 手术器械购置上海医疗器械（集团）有限公司, 手术剪(Y00030, 10cm直尖头），解剖剪(JD1050，10cm，直有钩)，眼科镊(JD1070，10cm直有钩)，显微镊（WA3210），显微剪（WA1030）
实验步骤
- 实验前准备
①标记好麦管编号。
②制作冻存管套，打好孔。标明麦管编号，长爪沙鼠品系，实验室PI，冻存日期和实验者。
③提前将浮漂和冻存管套放入液氮中进行预冷。
④做120 μL精子冻存剂(CPA)高滴。先用冻存保护剂做60 μL，覆盖少量矿物油后再加入60 μL，再用矿物油进行完全覆盖。
⑤另做两个30 μL的CPA洗滴，用于在显微镜下清洗附睾(去除脂肪和血)
⑥取2 ml左右HTF，用作于麦管的填充剂。
- 实验步骤
①挑选适龄雄鼠，对雄鼠安死术。长爪沙鼠的雄鼠一般选择10 w以上，最佳12～18 w。
②手术分离附睾，置常温的矿物油里清洗2遍；之后取出附睾，在吸水纸上去除上面肉眼可见的脂肪和血。
③将附睾放入30 μL CPA溶液的洗滴中，将附睾上残存的脂肪和血液完全清理干净。将附睾放入被矿物油覆盖的120 μL CPA做成的液滴中，用显微剪剪3下，让精子自然游出。
④常温下放在显微镜台面上3分钟，每分钟都要轻轻摇几下培养皿，使附睾中的精子可以尽量扩散到CPA中。用10μL移液器吸取精液，做成10μL的精液滴。
⑤接下来准备冻存管，用三通阀分别吸取150 μL HTF，30 μL空气，10 μL精子，然后吸取空气直至上端HTF溶液吸到麦管的过滤棉塞处。
⑥麦管两端用封口机进行封口。将封好口的麦管放入浮漂内，预冷10 min。
⑦10 min后将麦管放入液氮中的冻存管套里。
致谢
感谢国家自然科学基金项目（Nos. 31572341, 31572347, 31772545, 31572348）和国家科技支撑计划项目（No. 2015BAI09B00）的资助。
参考文献
- Low, B. E., Taft, R. A. and Wiles, M. V. (2016). Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery of Genetically Modified Mice. Methods Mol Biol 1438: 55-66.
引用格式：李长龙, 张静, 郭萌, 刘世景, 侯金莲, 朱艳敏, 吕珊, 杜小燕, 常在, 陈振文. (2021). 长爪沙鼠精子冷冻保存. // 实验动物胚胎操作实验手册.
Bio-101: e1010927. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010927.
How to cite: Li, C. L., Zhang, J., Guo, M., Lui, S. J. Hou, J., L, Zhu, Y., M., Lv, S., Du, X., Y., Chang, Z., and Chen, Z., W. (2021). Sperm Cryopreservation of Mongolian Gerbil. // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals.
Bio-101: e1010927. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010927.
