The Cytophagy of Aβ Microsphere Particles by Microglia   

材料与试剂

1. 各种规格的细胞培养板均购自美国Corning公司
2. BV2来源于中科院生化细胞所细胞库
3. Anti-β-Amyloid (mouse monoclonal, 6E10), 803016, BioLegend (用来标记Aβ) 
4. Anti Iba1 (rabbit), 019-19741, WAKO (用来标记IBa1) 
5. Donkey anti-rabbit 488, A21206, Invitrogen (对应一抗Anti-β-Amyloid) 
6. Donkey anti-mouse 594, A21203, Invitrogen (对应一抗Anti Iba1) 
7. Donkey Serum, 017-000-121, Jackson Lab
8. 胎牛血清，VS500T, Ausbian购自上海天蔚钧生物科技有限公司
9. Aβ冻干粉购自吉尔生化上海有限公司
10. F12培养基 (无酚红) 购自美国Gibco公司
11. DMSO, D2650, Sigma
12. 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI), E607303，上海生工生物有限公司
13. 4%多聚甲醛固定液PFA, E672002，上海生工生物有限公司
14. DPBS，02-023-1ACS，BI
15. 含EDTA的胰酶，25300062，Gibco
16. TritonX-100，A600198，BBI
    

仪器设备

1. 细胞培养箱 (Eppendorf, C170i)
2. 离心机 (Eppendorf, 5810R)
3. 全自动细胞计数仪 (Countstar, Countstar FL)
4. 超声破碎仪 (Covaris, S220)
5. 高通量活细胞分析仪 (Thermo Fisher Cellomics VTI700)
   

实验步骤

1. 细胞铺板
   1.1

   待BV2汇合度达到80%后，将BV2细胞用DPBS (02-023-1ACS，BI) 洗一遍，加入含0.05% EDTA的胰酶并放入细胞培养箱中消化3 min。
   1.2

   消化完成后，加入含有FBS的培养基终止消化。用移液管将细胞吸入离心管中，置于离心机500 × g, 5 min。
   1.3

   弃去上清，用新鲜培养基重悬细胞并进行计数。
   1.4

   将细胞按照5000个/孔接种于96孔板中。
2. Aβ处理
   2.1

   细胞培养24 h后加入不同浓度Aβ孵育。
   2.2

   用细胞培养基将100 μM的Aβ存储液稀释分别得到2 μM和6 μM Aβ工作液。
   2.3

   96孔细胞培养板的培养基体积为100 μl，将37 °C预热的Aβ工作液100 μl加入培养板中，保留孔板中原有的培养基，添加一倍培养基以免对细胞产生影响，最终Aβ工作浓度分别是1 μM和3 μM。
   2.4

   将96孔板继续置于细胞培养箱中孵育6 h，孵育时间根据实验条件进行摸索。
3. 细胞固定、通透封闭及染色
   3.1

   去除96孔板的培养基，每孔加入100 μl洗涤液 (PBS) 后放到摇床中，洗涤细胞3次，每次洗涤3-5 min。
   3.2

   每孔加入100 μl的固定液 (4%多聚甲醛)，室温固定15 min。
   3.3

   去除固定液，每孔加入100 μl洗涤液 (PBS) 后放到摇床中，洗涤细胞3次，每次洗涤3-5 min。
   3.4

   去除洗涤液，每孔加入100 μl通透液 (0.3% TritonX-100)，室温孵育10-15 min。
   3.5

   去除通透液，每孔加入100 μl封闭液，室温封闭30 min。
   3.6

   去除封闭液，首先使用抗体稀释液将6E10及Iba1抗体 (一抗) 按照1:200稀释后加入孔中，每孔50 μl，4 °C避光孵育过夜。
   3.7

   去除一抗，每孔加入100 μl洗涤液 (PBS) 后放入摇床中，洗涤细胞3次，每次洗涤3-5 min。
   3.8

   去除洗涤液，使用抗体稀释液将荧光二抗按照1:500稀释后加入孔中，每孔50 μl，室温避光孵育2 h。
   3.9

   去除二抗，每孔加入100 μl洗涤液 (PBS) 洗涤细胞3次，每次洗涤3-5 min。
   3.10

   用1x PBS将DAPI 1:1000稀释，去除洗涤液，每孔加入50 μl DAPI，室温避光孵育10 min。
   3.11

   去除DAPI，每孔加入100 μl洗涤液 (PBS) 洗涤细胞3次，每次洗涤3-5 min。
   3.12

   每孔加入100 μl DPBS放置4 °C储存。
4. 高内涵成像
   将96孔板底用擦镜纸拭后，置于高内涵细胞成像分析仪进行荧光成像及分析。利用10x物镜，添加红色、绿色成像通道，选择空白孔、阳性对照孔调整曝光时间、激发光强度进行实验拍摄。
   

结果与分析

1. 结果 (图1)
   
   
   图1. Aβ处理的BV2细胞 (红色：Iba1；绿色：6E10)
   
   
2. 分析
   2.1

   打开Cellomics软件，选择软件中自带的Autophagy进行简单修改，调整本次分析方法。通常情况下，选择细胞核所在的通道为第一分析对象，但因为细胞核这个通道并不能很好地圈出整个细胞的轮廓，故本方法选择了Iba1染色通道为第一分析对象，这样可以更好地圈出细胞的轮廓 (图2)。
   
   
   图2. Iba1确定细胞轮廓
   
   
   2.2

   确定Aβ染色通道 (图3)
   
   
   图3. Aβ染色
   
   
   2.3

   确定第三个分析通道为细胞核染色通道 (图4)
   
   
   图4. 细胞核染色通道
   
   
   2.4

   确定以细胞质为分析范围，调整smoothing和thresholding，其中smoothing数值的大小会影响圈出来的细胞质的边界的圆滑程度，thresholding就是通过固定的荧光强度来确定细胞质的边界 (图5)，调整上述两个参数以确保每个细胞质被合适的圈出来即可。
   
   
   图5. 确定细胞质做为分析Aβ被吞噬进入细胞的范围
   
   
   2.5

   选择被吞噬进入细胞质内的Aβ (图6)
   
   
   图6. 确定被吞噬进入细胞质内的Aβ
   
   
   2.6

   确定分析范围内的Aβ聚集情况，通过统计可发出荧光的点状物体的数量和大小评估最终实验结果；这个方法是在autophagy的protocol的基础上修改的，已经通过Iba1准确地圈出了整个细胞质的边界，故不需要再通过ring和circle设置范围确定被吞噬进入细胞质的Aβ (图7)。
   
   
   图7. 被圈出的Aβ聚集物
   
   
   2.7

   再次确定已经选定的红色的点可以表达被吞噬进入细胞的Aβ聚集物 (图8)
   
   
   图8. 分析参数的确定
   
   
   2.8

   Select features to store选择平均每个细胞内的点的个数来进行最终分析 (图9)
   
   
   图9. 分析参数的确定
   
   
   2.9

   Scan plate开始分析
   2.10

   由于这次分析的平均每个细胞内的点的个数是以Ibal所标记的细胞质为分析范围的，而在这种情况下Iba1圈出的范围有的并不能很好的区分开，因此还需要重新以DAPI的通道计数出细胞的个数 (表1)。
   
   表1. 高内涵统计数据分析
   
   
   解析：表格里面的DAPI个数是以细胞核为分析通道进行统计出来的分析通道的个数，可以准确地反应出细胞个数；而细胞质个数是以Iba1为分析通道统计出来的分析对象的个数，可能会因为荧光强度的强弱将一个细胞划分成两个，或者将两个细胞统计为一个，所以不能非常准确地反映出细胞个数，因此需要利用两组数据重新计算才能导出准确的被细胞吞噬进入细胞质的Aβ聚集物的个数。Spot的平均个数是以所有的Aβ聚集物的个数为分子，细胞质个数为分母得到的。每个细胞中的Aβ的个数是以所有的Aβ聚集物的个数为分子，DAPI标记的细胞核个数为分母得到的。我们最终是希望得到每个细胞吞噬Aβ的平均个数，因此需要重新进行计算。公式如下：
   每个细胞中的Aβ的个数 = (Spot平均个数 × 细胞质个数) /DAPI个数

溶液配方

1. 抗体稀释液
   1% Donkey Serum于含有0.1% Triton X-100溶于PBS中，现用现配
2. 封闭缓冲液
   10% Donkey Serum于含有0.1% Triton X-100溶于PBS中，现用现配
3. Aβ储存液
   1 mg Aβ溶于200 μl HFIP, 20 μl/管分装，得到0.1 mg/管，氮气挥干后，-80 °C保存，使用前DMSO重悬成5 mM (加入4.4 μl) 超声10 min。加入无酚红的DMEM/F12制成100 μM Aβ悬液 (加入217 μl) , 4 °C静置24 h后方可使用。
4. BV2细胞培养基成分
   10%FBS + DMEM/F12 + 1%双抗，4 °C保存
   

致谢

感谢国家蛋白质中心复合激光显微镜系统提供高内涵细胞分析仪的设备及技术人员的辅助。该项目受国家重点研发计划2018YFA0107903和2017YFA0104102，国家自然科学基金81701054的支持资助。

参考文献

1. Garden, G. A. and Moller, T. (2006). Microglia biology in health and disease. J Neuroimmune Pharmacol 1(2): 127-137.
2. Gehrmann, J., Matsumoto, Y. and Kreutzberg, G. W. (1995). Microglia: intrinsic immuneffector cell of the brain. Brain Res Brain Res Rev 20(3): 269-287.
3. Kofler, J. and Wiley, C. A. (2011). Microglia: key innate immune cells of the brain. Toxicol Pathol 39(1): 103-114.
4. Li, F., Zhu, S., Wu, C., Yan, C., Liu, Y. and Shugan, L. (2011). Neuroinflammation and cell therapy for Parkinson's disease. Front Biosci (Schol Ed) 3: 1407-1420.