摘要:细胞增殖检测是一种常用的生物学实验方法,主要反映细胞生长、周期及活力的情况。MTT、CCK8法和CellTiter-Lumi™化学发光法基于细胞活力检测细胞增殖,受细胞中代谢酶活性的影响。而5-乙炔-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine, EdU)掺入可以直接检测细胞中的DNA合成,反映细胞周期中S期情况,并且比基于抗体检测的5-溴-脱氧尿嘧啶核苷(bromo-deoxyuridine,BrdU)法,操作简便、检测灵敏性高。EdU是一种新型胸腺嘧啶脱氧核苷酸类似物,可以在DNA合成过程中代替胸苷掺入到新合成的DNA中(Cavanagh et al., 2011)。EdU耦联的乙炔基可与荧光探针耦联的叠氮化物经过一价铜离子催化形成稳定的三唑环,简称为点击反应(Click reaction)(Goonewardena et al., 2013)。新合成的DNA可通过荧光标记被高内涵细胞成像分析仪识别并计算EdU阳性细胞数,从而比较细胞增殖能力,该方法可用于高通量筛选。
关键词: 细胞增殖检测, 细胞周期, EdU, 高内涵细胞成像分析仪
研究背景
细胞的异常增殖是造成肿瘤发生的原因之一。在研究肿瘤发生发展的过程中,能准确反映细胞增殖的检测方法显得尤为重要。在该方法中,我们检测了结直肠癌细胞系HT29细胞的增殖能力。EdU染色可标记处于细胞周期S期的细胞,结合高内涵细胞成像分析仪计算出EdU阳性细胞占总细胞的比例。我们可通过比较处于S期的细胞比例判断细胞的增殖能力。该方法适用于检测多因素影响细胞增殖、细胞数量较少的实验案例。该实验方法的优势在于能一次性得到高通量的结果。
材料与试剂
- 96孔细胞培养板(Corning, catalog number: 3599)
- 离心管(Corning, catalog number: 430791)
- HT29细胞
- RPMI-1640培养基(Gibco, catalog number: 11875093)
- 胎牛血清 FBS(Excell Bio, catalog number: FSP500)
- 双抗(Gibco, catalog number: 15140122)
- DPBS(Gibco, catalog number: C14190500CP)
- 含EDTA的胰酶(Invitrogen, catalog number: 25200114)
- BeyoClickTM EdU-555 细胞增殖检测试剂盒(Beyotime, C0075S)
- 1×PBS(见溶液配方)
- 4%多聚甲醛(见溶液配方)
- 3% BSA(见溶液配方)
- 0.3% TritonX-100(见溶液配方)
仪器设备
- 细胞培养箱(Heraeus, model: HERAcell 150)
- 离心机(Eppendorf, model: 5810R)
- 移液器(Eppendorf)
- 全自动细胞计数仪(Bodboge, JSY-SC-021H)
- 高内涵细胞成像分析仪(Perkin Elmer, Operetta)
软件
- Harmony 4.8
实验步骤
- 铺细胞
- 细胞的EdU标记
- 细胞固定及通透
- Click反应
- 细胞核染色
- 高内涵成像
将96孔板板底用擦镜纸擦拭后,置于高内涵细胞成像分析仪Operetta进行荧光成像及图像分析。Azide 555的最大激发波长是555 nm,最大发射波长是565 nm,Hoechst 33342为蓝色荧光,最大激发波长为346 nm,最大发射波长为460 nm。打开Harmony软件,使用10x长工作距离物镜,添加EdU荧光通道和Hoechst 33342荧光通道,基于Hoecsht33342通道初步确定聚焦高度,针对EdU通道微调聚焦高度。根据荧光强度调整曝光时间,每孔选择9视野进行拍摄。
视频1. 96孔板换液洗涤操作视频
结果与分析
HT29细胞经EdU/Hoechst 33342荧光标记后,利用高内涵细胞成像分析仪采集荧光信号(图1)。
图 1. EdU法检测细胞增殖
Harmony 图像分析方法:首先基于Hoechst 33342通道图像进行细胞核圈选,然后对细胞核内的EdU荧光强度进行定量,基于视野内无细胞区域和EdU阴性细胞的EdU荧光强度确定荧光阈值,将EdU阳性的细胞群并定义为EdU+,计算每孔EdU阳性细胞的比例,即可比较细胞增殖能力。按照下图2 Harmony软件高内涵分析流程进行,表1对流程中的参数进行了详细的说明。图像分析软件给出的最终数据格式如图3。
图 2. Harmony软件高内涵分析流程。A. 图像分析流程界;B. 分析过程关键步骤圈选效果图
表 1. Harmony软件高内涵分析流程参数说明
图 3. 图像分析结果格式。A. 分析结束后软件给出各孔参数的数据格式;B. 软件给出整板各参数数据热图。
溶液配方
- 1×PBS
在蒸馏水中溶解NaCl 8 g,KCl 0.2 g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24 g,加水定容至1 L,调节pH值到7.2~7.4。
- 4%多聚甲醛
称取4 g多聚甲醛加入1× PBS中,缓慢搅拌加热,滴加NaOH使溶液变为碱性帮助溶解,溶液澄清冷却后,加入盐酸调整pH值至7.2~7.4,定容至100 ml,在4°C避光保存。
- 3% BSA
在100 ml 1× PBS中加入3 g BSA,溶解至澄清。
- 0.3% TritonX-100
在100 ml 1× PBS中加入0.3 ml TritonX-100,溶解至澄清。
致谢
感谢中国科学院生物化学与细胞生物学研究所化学生物学技术平台全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然科学基金面上项目(81874201),上海市自然科学基金(20ZR1452300),上海市卫计委课题(201840359)资助。本实验方法根据碧云天公司的细胞增殖检测试剂盒(C0075S)进行实施。
参考文献
- Cavanagh, B. L., Walker, T., Norazit, A. and Meedeniya, A. C. (2011). Thymidine analogues for tracking DNA synthesis. Molecules 16 (9): 7980-7993.
- Goonewardena, S. N., Leroueil, P. R., Gemborys, C., Tahiliani, P., Emery, S., Baker, J. R., Jr. and Zong, H (2013). Fluorogenic 'click-on' dendrimer reporter for rapid profiling of cell proliferation. Bioorg Med Chem Lett 23 (7): 2230-2233.
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Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:何璐薇, 赵宏伟, 林谋斌. (2021). 细胞增殖的EdU荧光标记法. // 高内涵成像及分析实验手册.
Bio-101: e1010840. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010840.
How to cite: He, L. W., Zhao, H. W., Lin, M. B. (2021). EdU Fluorescence Labeling for Cell Proliferation. // High-Content Imaging and Analysis Protocol eBook.
Bio-101: e1010840. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010840.