摘要:在秀丽隐杆线虫中,大量不同种类的小RNA广泛地存在于各个生长时期的多种组织细胞中。对小RNA进行深度测序,可以通过序列和表达量等信息更全面的了解和研究小RNA。秀丽线虫存在大量的次级siRNA,它们的5′端是三磷酸修饰,必须经过处理之后,转变为单磷酸,才能连接linker和进行深度测序(如图一)。本实验的原理是,利用不同的修饰酶对从线虫里提取的小RNA进行前期处理,然后再深度测序,可以得到不同修饰的小RNA的测序结果,从而有助于对小RNA进行更好的鉴定与分类。
图1. 修饰酶对不同类型small RNA的加工模式
关键词: 秀丽隐杆线虫, RNA提取, 小RNA磷酸化修饰
研究背景
在秀丽隐杆线虫的RNA干扰过程中,外源的双链RNA(dsRNA)被注射或喂食到线虫体内后,被DICER切割成短的dsRNA,再由RDE-1结合,进而诱导靶标mRNA的降解沉默。之后在RdRP(RNA dependent RNA Polymerase,RNA依赖的RNA聚合酶)的作用下,诱导次级siRNA,即22 GRNA生成,并被WAGO蛋白结合。另外,线虫体内还存在有内源性的初级siRNA,这类小RNA长为26nt,5’末端为G且有单磷酸修饰,被称为26G RNA。26G RNA也可以作为沉默的初级信号,诱导次级小RNA,22G RNA的生成(Billi et al., 2014)。22G RNA长为22 nt,5’末端为G且具有三磷酸修饰,使得该RNA并不能直接建库测序。对这一类22G RNA进行测序时,需要将RNA的5’末端的三磷酸处理为单磷酸结构,进而进行建库测序(Ruby et al., 2006; Gu et al., 2012)。其中CIAP可以将RNA 5’末端的磷酸基团去除,转为羟基,而T4 PNK可以将5’末端羟基加上单磷酸修饰。使用CIAP和T4 PNK处理,可以对三磷酸修饰的小RNA后续的建库和测序。
材料与试剂
一、一次性耗材
- Billi, A. C., Fischer, S. E. and Kim, J. K. (2014). Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook: 1-49. 1.RNase free离心管 50 ml Corning, catalog number:430828),15 ml(Corning, catalog number:430791),1.5 ml(Nest, catalog number:615001)
- 普通离心管 15 ml,50 ml
- RNase free枪头 1,000 μl,200 μl,20 μl,10 μl
- 一次性口罩Axygen, catalog number: TF-1000-R-S, TF-200-R-S, TF-20-R-S, TF-10-R-S)
- 一次性培养皿 直径90 mm,60 mm,35 mm(培养线虫用)
- 超声破碎管(Invitrogen,catalog number: Q3285)
二、生物材料
- 秀丽隐杆线虫(实验室培养)
- 大肠杆菌OP50(实验室培养)
三、溶液与试剂
- MgSO4(Sangon Biotech, catalog number: A601988)
- NaCl(Sangon Biotech, catalog number: A610476)
- Na2HPO4(Sangon Biotech, catalog number: A501727)
- KH2PO4(Sangon Biotech, catalog number: A100781)
- NP-40(Sangon Biotech, catalog number: A800385)
- Tris(Sangon Biotech, catalog number: A600194)
- NaOH(Sangon Biotech, catalog number: A100583)
- NaClO(国药, catalog number:7681-52-9)
- MgCl2(Sangon Biotech,catalog number: A100288)
- DEPC-treated water(Sangon Biotech, catalog number: B50100,预冷)
- TRIzol(Life technologies, catalog number: 15596026,预冷)
- Chloroform,氯仿(索莱宝,catalog number: P1014预冷)
- 75%乙醇(100%乙醇:DEPC-treated water 3:1,预冷)
- Isopropanol,异丙醇(Sangon Biotech, catalog number: A507048,预冷)
- RNase inhibitor (Thermo fisher,catalog number: EF0651,storage at -20 °C)
- DNase I (Thermo fisher, catalog number: 18047019, storage at -20 °C)
- RNA 5′ Polyphosphatase (Lucigen, catalog number: RP8092H, storage at -20 °C)
- CIAP (Invitrogen, catalog number: 18009019, storage at -20 °C)
- T4 PNK(Thermo ScientificTM EK0031, storage at -20 °C)
- Glycerol(Sangon Biotech, catalog number: A600232)
- 10x M9(见溶液配方)
- 2x bleach液(见溶液配方)
- Sonication buffer(见溶液配方)
仪器设备
一、实验器皿
- 玻璃瓶 1,000 ml,500 ml,250 ml,100 ml
- 塑料量筒 500 ml,200 ml,100 ml
- 玻璃移液管 15 ml,25 ml
二、仪器设备
- 摇床(海门其林贝尔, TS-8)
- 冷冻离心机(Eppendorf, 5415R)
- 普通离心机(Eppendorf, Centrifuge 5702)
- 37 °C烘箱(上海智诚,ZDP-2120)
- 冰箱(20 °C,4 °C,-20 °C,-80 °C)
- Vortex(IKA,Vortex2)
- 超声破碎仪(Diagenode,Bioruptor UCD-200)
- 体式显微镜(MOTIC,SMZ168)
- 电子秤(梅特勒,AL104)
- 高温高压灭菌锅(致微,G154DWS)
- 电子移液枪(Eppendorf)
- 移液枪(Brand, 1,000 μl,200 μl,20 μl,2 μl)
- 真空泵(海门其林贝尔,GL802B)
实验步骤
实验步骤流程如图2所示。
图2. 实验步骤流程示意图
一、收取线虫样品(以Late Young Adult时期线虫为例)
- 使用90 mm培养皿固体培养线虫(一支样品约需2个培养皿的线虫,约4,000到6,000条,由此提供下一代线虫),待培养皿上线虫数量足够多且大部分到达成虫时期(注:提供足够的细菌食物,别让培养皿上线虫进入饥饿状态),进行线虫同步化。
- 线虫同步化操作:
- 用电子移液枪和玻璃移液管吸取10 ml 1x M9将培养皿上的线虫转移到15 ml离心管中。
- 转移完成后,将离心管离心(2,500 rpm,0.5 min),保留管中5 ml液体,弃多余液体。再加入5 ml 2x bleach液,在摇床上快速震荡约5 min(可提前在体式显微镜下观察,大部分虫体破碎即可),离心(2,500 rpm,0.5 min),弃上清。
- 加入5 ml 1x M9清洗,涡旋混匀,离心(2,500 rpm,0.5 min),弃上清,重复此步骤3次。用枪头适度轻柔吹打,将沉淀的虫卵重悬之后,逐滴转移到90 mm培养板上,培养板放置于20 °C恒温培养箱中培养,约2.5-3.5天后发育到年轻成虫后期(注:不同基因型或者突变背景的线虫品系,到达年轻成虫后期的时间有所不同,以大部分线虫即将产卵或刚开始产卵的时间为准。另外,每个板上转移配置的虫卵要适量,防止线虫培养过程中进入饥饿状态)。
- 收集并清洗线虫。将同步化后Late Young Adult时期的线虫冲洗到15 ml离心管中,离心(2,500 rpm,0.5 min),弃上清(用真空泵吸出,注意不要将虫子吸出)。加入10 ml 1x M9,放在摇床上缓慢摇动约10 min,离心(2,500 rpm,0.5 min),弃上清,再加入10 ml 1x M9离心(2,500 rpm,0.5 min),弃上清。将线虫转移至1.5 ml RNase free离心管,每管约40 μl虫体(约1000-2000条成虫)。一管虫体作为一份样品。样品需冻存在-80 °C冰箱中。
二、核酸提取(注:后续实验时带好口罩,防止吸入有毒试剂及RNA被污染,实验均用RNase free枪头,所用离心管均为RNase free离心管,所有离心均在冷冻离心机中,加试剂间隙尽量将样品放在冰上,建议将所用的1.5 ml 离心管预冷。)
- 取出-80 °C冰箱中的样品,加入1 ml sonication buffer,待样品融化后,使用冷冻离心机离心(1,000 rpm, 1 min),弃上清,留下沉淀及液体约40 μl。
- 用移液枪打匀并吸取30 μl虫体到500 μl超声破碎管中,加入70 μl sonication buffer,加入RNase inhibitor(4 μl/1,000 μl sonication buffer)。
- 用超声破碎仪(Biorupter UCD200,15S ON, 45S OFF,Middle level)循环6次进行虫体破碎,每两个循环取出样品离心一次,1,000 rpm,1 min。
- 将100 μl液体转移到1.5 ml 离心管中。
- 加入400 μl TRIzol(预冷,TRIzol为易挥发有毒试剂,谨防吸入),涡旋混匀10 s,快速离心10 s。
- 加入100 μl 氯仿(预冷,氯仿为易挥发有毒试剂,谨防吸入),涡旋混匀10 s,冰上静置至少1 min。
- 用冷冻离心机离心静置后的样品,12,000 rpm 15 min。吸取上清到新的1.5 ml 离心管中(可以观察到液体分层,上清透明,下层为粉红色,中层有破碎后的虫体等杂质,只吸取透明上清部分,建议将移液枪调到300 μl吸取)。
- 加入300 μl 异丙醇(与离心管中的液体体积对等,预冷),轻微来回颠倒离心管,充分混合液体,放在冰上或4 °C冰箱中静置,1 h以上(注:可以放在4 °C或 -20 °C冰箱中过夜静置)。
- 冷冻离心机离心静置后的样品,12,000 rpm 15 min。(可以观察到离心管底部有白色沉淀,此为核酸)
- 用真空泵吸尽上清(注:也可用移液枪将上清吸尽),加入400 μl 75%乙醇(预冷),12,000 rpm离心3 min。洗两次。弃尽上清。
- 将离心管开盖,让未吸尽的液体蒸发(3-5 min),加入20 μl DEPC-treated water(预冷)溶解核酸。
三、用DNase I消化(将核酸中的DNA降解,保留RNA)
- 在核酸溶液中加入DNase I消化体系,静置于37 °C烘箱中,30 min。反应体系如下:
10x DNase I buffer 5 μl
DNase I 2 μl
RNA inhibitor 1 μl
DEPC-treated water22 μl - 重复步骤8-14。(注:即从加入TRIzol,氯仿至DEPC-treated water溶解核酸的所有步骤)
四、用CIAP酶处理 [将5′三磷酸(5′ ppp-NN)或5′单磷酸(5′ p-NN)RNA处理成5′端羟基(5′ OH-NN)]
- 在核酸溶液中加入CIAP酶或者FastAP酶消化体系,静置于37 °C烘箱中,30 min。反应体系如下:
10x CIAP buffer 5μl
CIAP酶 2μl
RNA inhibitor 1μl
DEPC-treated water22μl - 重复步骤8-14。(注:即从加入TRIzol,氯仿至DEPC-treated water溶解核酸的所有步骤)
五、用T4 PNK酶修饰 [将5′端羟基(5′ OH-NN)RNA转化为5′ 单磷酸(5′ p-NN)RNA]
- 在核酸溶液中加入T4 PNK酶反应体系,静置于37 °C烘箱中,60 min。反应体系如下:
10x T4 PNK buffer A5 μl
T4 PNK酶 2 μl
RNA inhibitor 1 μl
ATP 1 μl
DEPC-treated water21 μl
注:也可使用RNA 5′ polyphosphatase (Epicenter)代替第17-19步,直接将5′三磷酸(5′ ppp-NN)RNA转化成5′单磷酸(5′ p-NN)RNA,使用方法可参考RNA 5′ polyphosphatase (Epicenter)使用手册。- 重复步骤8-14。(注:即从加入TRIzol,氯仿至DEPC-treated water溶解核酸的所有步骤)
六、Small RNA-seq(注:如需检测带有5′三磷酸的小RNA,做完第20步后测序;如只检测5′单磷酸的小RNA,跳过17-20步)
- 将RNA溶液送测序公司,每个RNA样品3μg即可,选择RNA条带大小为18~ 40nt,使用NEBNext ®Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina试剂盒进行建库,将建库得到的DNA使用安捷伦生物分析仪2100进行分析后,进行单端深度测序。
溶液配方
- 10x M9
| Total 1,000 ml |
NaCl | 50 g |
Na2HPO4 | 60 g |
KH2PO4 | 30 g |
ddH20 | 990 ml |
上述试剂配置完,使用灭菌锅进行120 °C 高压灭菌20分钟,待溶液冷却后,再加入10 ml 1 M MgSO4。
注:用ddH2O稀释10x M9 10倍,配置成1x M9使用。
- 2x bleach液
| Totol 200 ml |
10 M NaOH | 20 ml |
NaClO溶液(活性氯 >= 5.2%) | 80 ml |
ddH2O | - ml
|
- Sonication buffer
| stock | Total 500 ml |
0.5% NP-40 | | 2.5 ml |
20 mM Tris pH 7.5 | 1 M | 10 ml |
200 mM NaCl | 5 M | 20 ml |
2.5 mM MgCl2 | 1 M | 1.25 ml |
10% glycerol | | 50 ml |
DEPC-treat water | | 补齐至500 ml |
注:10% glycerol 可稍微加热后量取,sonication buffer存放于RNase free处理的玻璃试剂瓶中,存放于4 °C。
致谢
该文章得到了国家重大科学研究计划(批准号: 2018YFC1004500和2017YFA0102900)、国家自然科学基金(批准号: 31671346,91940303,31870812,31871300,31900434)的支持。该实验方案改编自光寿红教授课题组的实验操作手册,在此向该实验室的老师和同学们表示感谢;使用该实验方案发表的文章(Zhou et al., 2017; Zhu et al., 2018)
参考文献
- Billi, A. C., Fischer, S. E. and Kim, J. K. (2014). Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook: 1-49.
- Gu, W., Lee, H. C., Chaves, D., Youngman, E. M., Pazour, G. J., Conte, D., Jr. and Mello, C. C. (2012). CapSeq and CIP-TAP identify Pol II start sites and reveal capped small RNAs as C. elegans piRNA precursors. Cell 151(7): 1488-1500.
- Ruby, J. G., Jan, C., Player, C., Axtell, M. J., Lee, W., Nusbaum, C., Ge, H. and Bartel, D. P. (2006). Large-scale sequencing reveals 21U-RNAs and additional microRNAs and endogenous siRNAs in C. elegans.Cell 127(6): 1193-1207.
- Zhou, X., Feng, X., Mao, H., Li, M., Xu, F., Hu, K. and Guang, S. (2017). RdRP-synthesized antisense ribosomal siRNAs silence pre-rRNA via the nuclear RNAi pathway. Nat Struct Mol Biol 24(3): 258-269.
- Zhu, C., Yan, Q., Weng, C., Hou, X., Mao, H., Liu, D., Feng, X. and Guang, S. (2018). Erroneous ribosomal RNAs promote the generation of antisense ribosomal siRNA. Proc Natl Acad Sci U S A 115(40): 10082-10087.
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Q&A
Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:曾陈明, 翁晨春, 朱成明, 光寿红. (2022). 秀丽隐杆线虫小RNA提取与多磷酸修饰处理.
Bio-101: e1010812. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010812.
How to cite: Zeng, C. M., Wen, C. C., Zhu, C. M. and Guang, S. H. (2022). Extracting and Sequencing of Small Interfering RNAs in
Caenorhabditis elegans.
Bio-101: e1010812. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010812.