RNA Pulldown Assay   

材料与试剂

1. 1.5 ml EP管 (上海生工生物，catalog number: F601620-9001)
2. cOmplete^TM, Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche, catalog number: 04693124001) 
3. 5x SDS loading buffer (Beyotime，P0015L) 
4. Biotin RNA labeling mix: (Roche, catalog number: 11685597910) 
5. MEGAscript^TM SP6/T7 Transcription Kit (Invitrogen^TM, catalog number: AM1330/ AM1333) 
6. Dynabeads^TM M-280 Streptavidin (Invitrogen^TM, catalog number: 11206D) 
7. Tris-HCl (上海生工生物，catalog number:B041188) 
8. KCl (国药，CAS 7447-40-7) 
9. MgCl₂ (麦克林，CAS 7786-30-3) 
10. DTT (北京索莱宝科技有限公司，CAS 3483-12-3) 
11. NP-40 (Beyotime, catalog number: P0013F) 
12. Na₂HPO₄·12H₂O (国药集团化学试剂有限公司 CAS 10039-32-4) 
13. KH₂PO₄ (国药集团化学试剂有限公司 CAS：7778-77-0) 
14. DNase I (Invitrogen，catalog number:AM2238) 
15. EDTA (Sigma，catalog number:E9884) 
16. RNA Clean and Concentrator-5 kit (Zymo Research，catalog number:R1013)
17. BCA定量蛋白试剂盒 (Beyotime，catalog number:P0009) 
18. RIP buffer (见溶液配方) 
19. NT2 buffer (见溶液配方) 
20. NT2 high salt buffer (见溶液配方) 
21. 10x PBS buffer (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 小型低温离心机
2. 移液器
3. 移液枪
4. 磁力架
5. 旋转仪
6. 伯乐电泳仪
7. 伯乐转膜仪
8. 恒温金属浴震荡仪
   

实验步骤

1. 体外转录：
   1.1

   体外转录RNA的Biotin标记
   加样体系
   1 μg of linearized plasmid                                                   x μl
   Biotin RNA labeling mix                                                       2 μl
   10x transcription buffer                                                       2 μl
   RNase-free water x μl to total                                             20 μl
   RNA polymerase (T7 or Sp6，产生正义或者反义的RNA) 2 μl
   注: 此处的正义或者反义的带标记的RNA，分别在2个EP管内制备，反义RNA将作为实验的负对照组。
   1.2

   将上述样品混合物短暂混合并离心，在37 °C孵育2 h。 加入2 μl DNase I (Ambion)，在37 °C下孵育15 min。 加入2 μl 0.2 M EDTA混合。混合后亦可在-80 °C下保存，后续待用。
   1.3

   使用RNA Clean and Concentrator-5 kit (Zymo Research) 纯化体外转录的 RNA，详细步骤参见试剂盒说明书；或用苯酚/氯仿抽提RNA，然后用乙醇沉 淀。不同长度及序列特征的RNA转录效果不同，一般建议20 μl水洗脱进行 尝试。
2. 制备细胞裂解液：
   2.1

   取1盘10 cm培养皿细胞，细胞汇合度约为90%，加入3 ml预冷的PBS清洗细胞，然后用移液枪吸去PBS。
   2.2

   加入1 ml RIP buffer (含1x cOmplete及2 μl RNase Inhibitor)，冰上裂解15-30 min。用移液枪轻吹打，使细胞从培养皿中轻轻脱落，将细胞裂解液从细胞培养皿里转移到1.5 ml EP管中。
   2.3

   4 °C 离心机15,000 × g离心10 min，将上清液用移液枪转移到新的1.5 ml的离心管中，用BCA法进行蛋白定量。取10 μl上述上清液留作western blot的"Input"。其余细胞裂解液置冰上备用。
3. 准备beads：
   3.1

   取20 μl Streptavidin beads于1.5 ml离心管中，将盛有beads的离心管放到磁力架上，静置1min，吸出beads store buffer。
   3.2

   加入1 ml PBS，上下颠倒混匀6-8次，短暂离心后，将离心管放置在磁力架上，静置1 min，去掉上层液。
   3.3

   重复步骤2。
4. 预清洗蛋白裂解液：
   4.1

   将第二步中准备好的细胞裂解液加入到盛有20 μl beads的离心管中，室温10 rpm旋转仪上旋转孵育1 h。
   4.2

   短暂离心后将1.5 ml EP管置于磁力架上，收集上清液用于后续的RNA pull down。向beads中加入500 μl NT2 buffer，待与步骤7中beads一起清洗作为"beads"阴性对照。
5. RNA-蛋白孵育：
   5.1

   取预清洗好的包含有1mg蛋白的细胞裂解液各1 mg于两个新1.5 ml EP管中，加2 μl RNase Inhibitor，再分别加2 μg Biotin 标记的正义及反义对照RNA (sense与antisense)。
   5.2

   4 °C 10 rpm条件下于旋转仪上旋转孵育1 h。
6. RNA Pulldown：
   同3中准备两份20 μl beads，加入到5中两个1.5 ml EP管中。4 °C 10 rpm旋转孵育1 h.
7. 洗涤beads：
   7.1

   在1.5 ml的EP管中加入500 μl NT2 buffer，4 °C 10 rpm旋转仪旋转洗涤5 min，短暂离心，将1.5 ml EP管放置在磁力架上，静置1 min，去上清。
   7.2

   重复步骤1，共洗涤3次。
   7.3

   在1.5 ml EP管中加入500 μl NT2 high salt buffer，4 °C 10 rpm于旋转仪旋转洗涤5 min，短暂离心，将1.5 ml EP管放置在磁力架上，静置1 min，去上清。
8. Pulldown蛋白检测：
   8.1

   每份beads加40 μl PBS与10 μl 5x SDS loading buffer (步骤2中Input样品 若需用于后续WB分析，也可进行此步操作) 100 °C煮样5-10 min，用于后 续Western Blot检测目标蛋白。
   8.2

   如用于质谱蛋白组检测，增加细胞至10盘 (10 cm 细胞培养皿)，Biotin-RNA 正义/反义 各10 μg，streptavidin-beads 各100 μl。

溶液配方

1. RIP buffer
   25 mM Tris-HCl pH 7.5
   150 mM KCl
   0.5 mM DTT
   0.05% NP-40
2. NT2 buffer
   50 mM Tris-HCl pH 7.4
   150 mM NaCl
   1 mM MgCl₂
   0.05% NP-40
3. NT2 high salt buffer
   NT2 buffer added to 500 mM NaCl
4. 10x PBS buffer
   NaCl 40 g
   KCl 1 g
   Na₂HPO₄-12H₂O 17.9 g
   KH₂PO₄ 1.35 g
   水定容至500 ml
   注：本实验中所有试剂均为用DEPC处理水配制，所有的实验用品都保证无DNase RNase,实验操作前最好用RNase喷雾清除剂擦拭清洁手套、实验台、移液器、冰盒等需用到的材料和器械。在操作过程中要注意穿戴好干净的口罩、手套、实验服等，避免杂质掉落到裂解液中，导致质谱检测分析中出现大量的角蛋白污染等。
   

致谢

我们感谢中国自然科学基金 (81672791, 81872300) 和浙江省杰出青年自然科学基金 (LR18C060002) 对我们实验工作的支持，同时也感谢实验室各位成员之间在科研工作中的密切协作和配合，使得我们的实验能够顺利，稳定进行。已发表的引用该方法的论文如下：(Xing et al., 2014; Lin et al., 2016, 2017; Sang et al., 2018, 2021).

参考文献

1. Lin, A., Hu, Q., Li, C., Xing, Z., Ma, G., Wang, C., Li, J., Ye, Y., Yao, J., Liang, K., Wang, S., Park, P. K., Marks, J. R., Zhou, Y., Zhou, J., Hung, M. C., Liang, H., Hu, Z., Shen, H., Hawke, D. H., Han, L., Zhou, Y., Lin, C. and Yang, L. (2017). The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nat Cell Biol 19: 238-251.
2. Lin, A., Li, C., Xing, Z., Hu, Q., Liang, K., Han, L., Wang, C., Hawke, D. H., Wang, S., Zhang, Y., Wei, Y., Ma, G., Park, P. K., Zhou, J., Zhou, Y., Hu, Z., Zhou, Y., Marks, J. R., Liang, H., Hung, M. C., Lin, C. and Yang, L. (2016). The LINK-A lncRNA activates normoxic HIF1alpha signalling in triple-negative breast cancer. Nat Cell Biol 18: 213-224.
3. Sang, L., Ju, H. Q., Yang, Z., Ge, Q., Zhang, Z., Liu, F., Yang, L., Gong, H., Shi, C., Qu, L., Chen, H., Wu, M., Chen, H., Li, R., Zhuang, Q., Piao, H., Yan, Q., Yu, W., Wang, L., Shao, J., Liu, J., Wang, W., Zhou, T. and Lin, A. (2021). Mitochondrial long non-coding RNA GAS5 tunes TCA metabolism in response to nutrient stress. Nat Metab 3: 90-106.
4. Sang, L. J., Ju, H. Q., Liu, G. P., Tian, T., Ma, G. L., Lu, Y. X., Liu, Z. X., Pan, R. L., Li, R. H., Piao, H. L., Marks, J. R., Yang, L., Yan, Q., Wang, W., Shao, J., Zhou, Y., Zhou, T. and Lin, A. (2018). LncRNA CamK-A regulates Ca²⁺-signaling-mediated tumor microenvironment remodeling. Mol Cell 72: 71-83 e77.
5. Xing, Z., Lin, A., Li, C., Liang, K., Wang, S., Liu, Y., Park, P. K., Qin, L., Wei, Y., Hawke, D. H., Hung, M. C., Lin, C. and Yang, L. (2014). lncRNA directs cooperative epigenetic regulation downstream of chemokine signals. Cell 159: 1110-1125.