摘要:土壤线虫是数量和功能类群最为丰富的一类土壤动物,线虫群落在土壤碎屑食物网中占有重要的地位,在维持土壤生态系统稳定、促进物质循环和能量流动方面发挥着重要的生态功能。本文论述了在土壤线虫群落研究过程中涉及的四个主要步骤 (不包含分类鉴定),即 (1) 土壤线虫的野外采集;(2) 土壤线虫的分离提取;(3) 土壤线虫标本制作;(4) 土壤线虫数据处理和统计分析。首先,合理的取样对于土壤线虫群落研究至关重要,它决定了结果的真实性和准确性;在实际工作中研究者需要根据不同的研究目的设计相应的取样方案。待取样全部完成后,研究者要尽快进行线虫的分离提取工作。目前国内外应用最广泛的三种分离提取方法为浅盘法、蔗糖漂浮离心法以及贝尔曼漏斗分离法;每种方法都有其优势、弊端及适用范围,应根据所提取线虫的具体用途来确定采用何种分离方法。分离得到的线虫需要制作成临时标本或者永久标本以便进行土壤线虫的科属分类鉴定。最终获得的土壤线虫科属的原始数据一般先要进行转换和标准化处理,然后再做进一步的统计分析。如果数据不符合正态分布,可以进行对数转换、立方根转换和倒数转换;数据标准化是为了达到小区间的方差齐性,或者使得同一小区内的不同属性间或同一属性在不同小区内的方差减小。通过上述样品制备过程,能够探明土壤线虫科属分布特征,可为土壤线虫群落研究奠定基础;通过线虫数据的统计分析,可以获得指示、反映土壤食物网结构和功能变化的重要结果。
关键词: 土壤线虫, 样品采集, 提取方法, 标本制作, 数据分析
研究背景
土壤线虫是丰富度与多样性最大的一类土壤动物。根据已发表的线虫种类估算,地球上至少有线虫10万种 (van den Hoogen et al., 2019)。此外,由于土壤线虫占据多个营养级,且能够对环境变化或干扰做出迅速响应,因此具有作为指示生物的独特优势 (傅声雷等,2019)。在土壤线虫群落研究过程中,除了专业性极强的分类鉴定工作外,还涉及以下四个主要步骤,即 (1) 土壤线虫的野外采集;(2) 土壤线虫的分离提取;(3) 土壤线虫标本制作;(4) 土壤线虫数据处理和统计分析。合理的取样及提取方法、可靠的标本制作方法以及准确的数据分析,对于获得线虫种属数据具有重要的作用。对于这些过程的操作规范性要求极高,只有遵循统一规范的操作步骤,才能最终获得准确翔实完整的土壤线虫数据。例如,如果取样方法不当,土壤样品不具有代表性,就可能对试验结果产生很大的影响,就无法得出正确的结论。常规土壤线虫的取样目的主要包括线虫群落调查、线虫病害诊断、线虫分类研究等 (张晓珂等,2013)。在取样过程中,研究者还要根据不同的取样目的去考虑取样深度、取样时间及取样数量等诸多因素。规范的土壤取样工作是线虫群落研究的基础,之后要进入重要的线虫分离提取阶段。线虫的分离提取方法有多种,且具有不同的优势、弊端及适用范围,可根据提取线虫的种类和数量、采集时间、土壤类型及所提取线虫的具体用途等选择最适合的方法 (刘维志,2004)。目前国内外通用的三种土壤线虫分离提取方法,即浅盘法 (Oostenbrink, 1960; Townshend, 1963; Verschoor and De Goede, 2000)、蔗糖漂浮离心法 (刘维志,1995; Coleman et al., 1999; 谢辉,2005) 以及贝尔曼漏斗分离法 (Viglierchio and Schmitt, 1983; Gray, 1984; Tomar et al., 2006),具体操作步骤规范将在本文做详细的介绍。提取到土壤线虫样品后,为了在土壤线虫科属分类鉴定过程中便于观察线虫细微的形态结构,通常都需要将分离到的线虫制作成玻片标本,用于线虫的形态观察和分类鉴定。用于鉴定的玻片标本通常有两种:一种为临时标本 (俗称水片),另一种为永久标本。临时标本的制作方法简单快速,不需要特殊的仪器设备及药剂,有利于快速鉴定线虫的种类;但该方法的弊端是制成的临时玻片保存时间较短,应该防止放置时间过长以致于线虫虫体变形,因此永久玻片更易于长时期保存,便于物种标本的积累、分类鉴定的学习以及学生教学的观察。
获得了土壤线虫群落或者种属信息后,为了利用这些有限的信息来直观地揭示出生态系统的变化,确定土壤虫多样性,必须借助于有效的多样性指数和分析方法 (李玉娟等,2005;张晓珂等,2018)。目前国内外研究者通常用香农-威纳指数 (Shannon-Weiner index, H′) 和辛普森指数 (Simpson index, λ) 等来评价土壤线虫的物种多样性 (Yeates, 1984; Yeates and Bongers, 1999);利用土壤线虫群落数据计算富集指数 (enrichment index, EI)、结构指数 (structure index, SI)、基础指数 (basal index, BI) 以及通路指数 (channel index, CI) 可以有效反映出土壤食物网对食物资源的预期响应及对食物网结构复杂性进行衡量 (Ferris et al., 2001; Yeates et al., 2003; 张晓珂等, 2012和2013)。此外,线虫代谢足迹也是一个可以用来评估进入食物网碳量的非常重要的指标 (Guan et al., 2018; Kou et al., 2020)。Ferris (2010) 也提出了线虫代谢足迹是由生产碳 (线虫的一个生活周期中碳分配到生长和繁殖中的量) 和呼吸碳 (通过呼吸作用释放的二氧化碳) 两部分组成。基于生长和呼吸中利用的碳来度量代谢活性和生态系统功能,研究者可以利用定量化的土壤线虫形态度量数据来反映和指示碳的代谢过程 (Ferris, 2010; Luo et al., 2021)。但迄今为止,还没有一种单一的线虫生态指数可以全面有效地揭示土壤线虫群落结构或者土壤食物网的变化,只有综合各种生态指数才能更好地发挥土壤线虫群落对土壤食物网的生物指示功能。综上,本文从土壤线虫的采集、分离提取、标本制作和数据分析这四个方面对土壤线虫的主要研究过程进行详细地阐述,以期对于土壤线虫群落研究提供一种标准化方法,利于土壤线虫研究的规范化。
一、土壤线虫采集
- 土壤收集方法
- 土壤线虫的分离提取方法
二、土壤线虫标本制作
- 临时标本
- 永久标本 (视频1)
三、土壤线虫相关指数计算及数据分析
如果数据不符合正态分布,可以进行适当转换,转换的方法主要有对数转换、立方根转换和倒数转换。土壤线虫数据常用的转换方法为:当线虫数量数据若不满足正态分布,在作统计分析前要进行Ln(x+1) 转换;对线虫的相对多度采用反正弦函数转换,以保证数据呈正态分布,然后再利用SPSS等软件进行统计学上的显著性检验。数据标准化是为了达到小区间的方差齐性,或者使得同一小区内的不同属性间或同一属性在不同小区内的方差减小。此外有些数量分析方法要求特殊的标准化处理,并将标准化作为其分析方法的一部分 (刘任涛,2016)。
- 土壤线虫物种多样性及群落分析指数
- 线虫代谢足迹
线虫代谢足迹:Σ(Nt (0.1 Wt / mt +0.273 (W0.75)))
某个属可以看作t;Nt是t属的多度; Wt 是t属生物量,mt是t属的cp值。
线虫代谢足迹的纵坐标轴 (Y-轴) 代表富集足迹,横坐标轴 (X-轴) 代表结构足迹。X-轴坐标为SI−0.5Fs 和 SI+0.5Fs,Y-轴坐标为EI−0.5Fe 和EI+0.5Fe (Fs和Fe分别为结构代谢足迹和富集代谢足迹) (Ferris, 2010)。功能代谢足迹为这些点 [(SI−0.5Fs,EI); (SI,EI+0.5Fe); (SI+0.5Fs,EI); (SI, EI−0.5Fe); (SI,EI)] 连接的区域。富集代谢指数 (enrichment footprint,efoot) 是指通常c-p值较低 (1-2) 且对资源富集反映迅速的一类线虫的代谢足迹;结构代谢指数 (structure footprint,sfoot) 反映的是c-p值较高 (3-5) 的一类线虫的碳代谢过程,这类线虫对食物网具有调节功能 (Neher et al.,2004; Ferris, 2010; Ferris et al., 2012)。功能代谢足迹是富集代谢和结构代谢圈定区域的总合。
- 线虫生产碳和呼吸碳
生产碳:Pt = (Nt × 20% × 52% × Wt × 1000) / mt
呼吸碳:CO2 − Ct = Nt × 0.273 × (Wt × 1000)0.75
某个属可以看作t;Nt是t属的多度; Wt 是t属生物量,mt是t属的cp值; 20%是鲜土到干土的转换系数 (Persson et al., 1980);52%是干土C含量(Persson, 1983);1000是从μg到g的转换系数; 0.273是C和CO2分子质量的比值。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目 (41977054和41771280) 和国家科技基础资源调查专项项目 (2018FY100304) 资助,同时感谢中国科学院森林生态与管理重点实验室与辽宁省现代保护性耕作和生态农业重点实验室的大力支持。
参考文献
- 傅声雷,张卫信,邵元虎,时雷雷,刘占锋. (2019). 土壤生态学−土壤食物网及其生态功能. 科学出版社. 北京.
- 李玉娟,吴纪华,陈慧丽,陈家宽. (2005). 线虫作为土壤健康指示生物的方法及应用. 应用生态学报 16(8): 1541-1546.
- 刘任涛. (2016). 土壤动物生态学研究方法−实验设计、数据处理与论文写作. 科学出版社. 北京.
- 刘维志. (1995). 植物线虫学研究技术. 辽宁科学技术出版社. 沈阳.
- 刘维志. (2004). 植物线虫志. 中国农业出版社. 北京.
- 谢辉. (2005). 植物线虫分类学. 高等教育出版社. 北京.
- 张晓珂,梁文举,李琪. (2013). 长白山森林土壤线虫−形态分类与分布格局. 中国农业出版社. 北京.
- 张晓珂,梁文举,李琪. (2018). 我国土壤线虫生态学研究进展和展望. 生物多样性26 (10): 1060-1073.
- Blair, J. M., Bohlen, P. J. and Freckman, D. W. (1996). Soil invertebrate as indicators of soil quality. In: Doran, J. W. and Jones, A. J. (Eds.). Methods for assessing soil quality. Soil Science Society of America, Inc. 273-291.
- Coleman, D. C., Blair, J. M., Elliott, E. T. and Wall, D. H. (1999). Soil inverbrates. In: Robertson, G. P., Coleman, D. C., Bledsoe, C. S. and Sollins, P. (Eds.). Standard soil methods for long-term ecological research. Oxford University Press. 349-337.
- Ferris, H. (2010). Form and function: metabolic footprints of nematodes in the soil food web. Eur J Soil Biol 46(2): 97-104.
- Ferris, H., Bongers, T. and de Goede, R. G. (2001). A framework for soil food web diagnostics: extension of the nematode faunal analysis concept. Appl Soil Ecol 18(1): 13-29.
- Ferris, H., Sánchez-Moreno, S. and Brennan, E. (2012). Structure, functions and interguild relationships of the soil nematode assemblage in organic vegetable production. Appl Soil Ecol 61: 16-25.
- Gray, N. (1984). Ecology of nematophagous fungi: comparison of the soil sprinkling method with the Baermann funnel technique in the isolation of endoparasites. Soil Biol Biochem 16(1): 81-83.
- Guan, P., Zhang, X., Yu, J., Cheng, Y., Li, Q., Andriuzzi, W. S. and Liang, W. (2018). Soil microbial food web channels associated with biological soil crusts in desertification restoration: the carbon flow from microbes to nematodes. Soil Biol Biochem 116: 82-90.
- Kou, X., Zhang, X., Bai, W., Cai, Q., Wu, Z., Li, Q. and Liang, W. (2020). Exploring N fertilizer reduction and organic material addition practices: an examination of their alleviating effect on the nematode food web in cropland. Land Degrad Dev 31(18): 2952-2961.
- Luo, J., Zhang, X., Kou, X., Xie, H., Bao, X., Mahamood, M. and Liang, W. (2021). Effects of residue mulching amounts on metabolic footprints based on production and respiration of soil nematodes in a long‐term no‐tillage system. Land Degrad Dev 32(7): 2383-2392.
- Neher, D., Weicht, T., Moorhead, D. and Sinsabaugh, R. (2004). Elevated CO2 alters functional attributes of nematode communities in forest soils. Funct Ecol 18(4): 584-591.
- Oostenbrink, M. (1960). Estimating nematode populations by some selected methods. In: Sasser, J. N. and Jenkins, W. R. (Eds.). Nematology. The University of North Carolina Press, Chapel Hill. 85-102.
- Persson, T. (1983). Influence of soil animals on nitrogen mineralisation in a northern Scots pine forest. Proceedings of the VIII Int Colloquium Soil Zool. 117-126.
- Persson, T., Bååth, E., Clarholm, M., Lundkvist, H., Söderström, B. and Sohlenius, B. (1980). Trophic structure, biomass dynamics and carbon metabolism of soil organisms in a Scots pine forest. Ecol Bull (Stockholm) 32: 419-459.
- Tomar, V., Baniyamuddin, M. and Ahmad, W. (2006). Community structure of soil inhabiting nematodes in a mango orchard at Aligarh, India. Int J Nematol 16(1): 89.
- Townshend, J. (1963). A modification and evaluation of the apparatus for the Oostenbrink direct cottonwool filter extraction method1. Nematologica 9(1): 106-110.
- van den Hoogen, J., Geisen, S., Routh, D., Ferris, H., Traunspurger, W., Wardle, D. A., de Goede, R. G. M., Adams, B. J., Ahmad, W., Andriuzzi, W. S., Bardgett, R. D., Bonkowski, M., Campos-Herrera, R., Cares, J. E., Caruso, T., de Brito Caixeta, L., Chen, X. Y., Costa, S. R., Creamer, R., da Cunha Castro, J., Dam, M., Djigal, D., Escuer, M., Griffiths, B. S., Gutiérrez, C., Hohberg, K., Kalinkina, D., Kardol, P., Kergunteuil, A., Korthals, G., Krashevska, V., Kudrin, A. A., Li, Q., Liang, W. J., Magilton, M., Marais, M., Martín, J. A. R., Matveeva, E., Mayad, E. H., Mulder, C., Mullin, P ., Neilson, R., Nguyen, T. A. D., Nielsen, U. N., Okada. H., Rius, J. E. P., Pan, K. W., Peneva, E., Pellissier, L., da Silva, J. C. P., Pitteloud, C., Powers, T. O., Powers, K., Quist, C. W., Rasmann, S., Sánchez Moreno, S., Scheu, S., Setälä, H., Sushchuk, A., Tiunov, A. V., Trap, J., van der Putten, W., V estergård, M., Villenave, C., Waeyenberge, L., Wall, D. H., Wilschut, R., Wright, D. G., Yang, J. and Crowther, T. W. (2019). Soil nematode abundance and functional group composition at a global scale. Nature 572: 194-198.
- Verschoor, B. C. and De Goede, R. G. (2000). The nematode extraction efficiency of the Oostenbrink elutriator-cottonwool filter method with special reference to nematode body size and life strategy. Nematology 2(3): 325-342.
- Viglierchio, D. and Schmitt, R. V. (1983). On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications. J Nematol 15(3): 438.
- Yeates, G. W. (1984). Variation in soil nematode diversity under pasture with soil and year. Soil Biol Biochem 16(2): 95-102.
- Yeates, G. W. (2003). Nematodes as soil indicators: functional and biodiversity aspects. Biol Fert Soils 37(4): 199-210.
- Yeates, G. W. and Bongers, T. (1999). Nematode diversity in agroecosystems. Agric Ecosyst Environ 74(1-3): 113-135.
- Zhang, X., Li, Q., Zhu, A., Liang, W., Zhang, J. and Steinberger, Y. (2012). Effects of tillage and residue management on soil nematode communities in North China. Ecol Indic 13(1): 75-81.
Please login or register for free to view full text
View full text
Download PDF
Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:骆静梅, 张晓珂, 梁文举. (2021). 土壤线虫采集、标本制作与数据分析.
Bio-101: e1010621. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010621.
How to cite: Luo, J. M., Zhang, X. K. and Liang, W. J. (2021). Soil Nematode Collection, Specimen Preparation and Data Analysis.
Bio-101: e1010621. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010621.