产品说明书：KAPA RNA HyperPrep试剂盒（Illumina^®平台）加RiboErase（HMR）GlobinVendor   

产品描述

用于Illumina测序平台、KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase（HMR）Globin包含去除rRNA和球蛋白mRNA转录物以及从25 ng-1 μg纯化的血源总RNA中构建Stranded RNA-Seq文库所需的所有缓冲液和酶，具体步骤如下：

1. 通过互补DNA寡核苷酸杂交和RNA酶H消化，去除与DNA寡核苷酸双链化的rRNA和球蛋白mRNA， 然后进行DNA酶处理以清除DNA寡核苷酸；
2. 采用加热和镁进行随机片段化；
3. 采用随机引物结合进行第一条链cDNA合成；
4. 结合第二条链合成和加A尾，将cDNA：RNA杂交体转化为双链cDNA（dscDNA），将dUTP掺入第二条cDNA链，进行Stranded RNA测序，并在所得dscDNA的3'末端加入dAMP；
5. 接头连接，即在文库插入片段上连接带有3' dTMP端的dsDNA接头；以及
6. 文库扩增，使用高保真低偏差PCR扩增在两端携带适当接头序列的文库片段。标记有dUTP的链未被扩增，允许进行链特异性测序。
   
   

该试剂盒提供了用于反应纯化的KAPA纯化磁珠，以及rRNA和球蛋白mRNA去除、cDNA合成、文库构建和扩增所需的所有酶和缓冲液。

反应缓冲液以方便的形式提供，包含所有需要的反应组分。这最大限度地降低了RNA酶污染的风险，确保了反应组分的一致性和均质性，并改善了重复样本之间的均一性。类似地，文库构建过程的每一个步骤都配有单独的酶混合物，从而减少了移液步骤的次数。

为了使序列覆盖均一性最大化，并维持相对的转录本丰度，尽量减少文库扩增偏差是至关重要的。KAPA HiFi DNA聚合酶是为低偏差高保真PCR而设计，是NGS文库扩增的首选聚合酶^{1, 2, 3, 4}。KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase（HMR）Globin包含用于文库扩增的KAPA HiFi热启动高保真酶预混液（2X）和文库扩增引物混合物（10X）。

1. Oyola, S.O., et al. BMC Genomics 13, 1 (2012).
2. Quail, M.A., et al. Nature Methods 9, 10-11 (2012).
3. Quail, M.A., et al. BMC Genomics 13, 341 (2012).
4. Ross, M.G., et al. Genome Biology 14, R51 (2013).

产品应用

KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase（HMR）Globin可用于手动操作或自动化操作,为总量为25 ng-1 μg的RNA进行NGS文库构建。该试剂盒可用于去除细胞质rRNA（5S、5.8S、18S和28S）和线粒体rRNA（12S和16S）及球蛋白mRNA转录物。该实验方法适用于多种类型的RNA测序应用，包括：

●高质量和低质量RNA样本的基因表达分析；
●单核苷酸多态性（SNV）分析；
●剪切点和基因融合突变识别；以及
●PolyA和非PolyARNA的表征，包括非编码和未成熟的RNA。

该试剂盒与长度 < 100 bp的小RNA不兼容。

工作流程图

实验操作流程

1. 试剂准备
   完成该实验方法耗时约6.5小时。理想情况下，应根据需要准备流程中不同步骤的反应预混液。
   
   为获得最高的稳定性和最长的保质期，KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase（HMR）Globin中的酶和反应缓冲液应单独提供。对于精简的实验方法，每一步酶促步骤都需要制备一份至少有10%多余量的试剂反应预混液，如表1-表7中所示。表8列出了KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase（HMR）Globin实验方法中所需的其他试剂的量。
   
   始终确保寡核苷酸杂交、rRNA/球蛋白mRNA去除和DNA酶消化所需的试剂，以及KAPA纯化磁珠和PEG/氯化钠溶液在使用前已经完全平衡至室温。
   
   表1. 寡核苷酸杂交
   
   *如果要处理非血源样本或遵循KAPA RiboErase（HMR）工作流程，必须用相同体积的不含RNA酶的水（1 μl）代替球蛋白杂交寡核苷酸（HMR）。更多相关信息，请参阅含RiboErase（HMR）的KAPA RNA HyperPrep试剂盒技术数据表—KR1351 v2.17（或更高版本）。
   
   表2. rRNA/球蛋白mRNA的去除
   
   
   表3. DNA酶消化
   
   
   表4. 第一条链合成
   
   
   表5. 第二条链合成与加A尾
   
   
   表6. 接头连接
   
   
   表7. 文库扩增
   
   
   表8. 其他所需试剂的量
   
   
   
2. 寡核苷酸的杂交与rRNA/球蛋白mRNA的去除
   该实验方法需要25 ng-1 μg、溶解于不含RNA酶水中的血液来源10 μl 纯化总RNA。
   
   1. 确保在使用前已准备好了杂交反应预混液（表1）和去除反应预混液（表2），并保存在室温。
   2. 如果要处理非血源样本或遵循KAPA RiboErase（HMR）工作流程，必须用相同体积的不含RNA酶的水代替球蛋白杂交寡核苷酸（HMR）。更多相关信息，请参阅含RiboErase（HMR）的KAPA RNA HyperPrep试剂盒技术数据表—KR1351 v2.17（或更高版本）。
   3. rRNA和球蛋白mRNA的去除效率可用qRT-PCR评估，这需要过程对照物（不含RNA酶H）。有关更多信息，请参阅原说明书附录B。
   2.1

   按如下方式设置热循环仪的程序：
   
   
   
   2.2

   按下述方式配制rRNA/球蛋白mRNA杂交反应：
   
   
   
   2.3

   用10 μl的移液量上下吹打至少10次，以彻底混匀RNA和杂交反应预混液。
   2.4

   将样本置于预编程的热循环仪中，并执行程序。
   2.5

   确保添加了含有RNA酶H的去除反应预混液，同时样本在热循环仪中于45 °C下保存。当程序在45 °C下到达暂停步骤时，在每个20 μl杂交反应中添加以下物质，并用10 μl的移液量上下吹打至少10次，以彻底混匀。
   
   
   
   2.6

   恢复循环程序，继续进行去除步骤（45 °C，持续30分钟）。
   2.7

   立即进行rRNA/球蛋白mRNA去除纯化（步骤3）。
   
   
3. rRNA/球蛋白mRNA去除纯化
   
   3.1

   结合以下方法，进行一次2.2X基于磁珠的纯化：
   
   
   
   3.2

   通过多次上下吹打彻底重悬磁珠。
   3.3

   将板/管在室温下孵育5分钟，以将RNA结合到磁珠上。
   3.4

   将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   3.5

   小心吸出并丢弃75 μl的上清液。
   3.6

   将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
   3.7

   在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   3.8

   小心吸出并丢弃乙醇。
   3.9

   将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
   3.10

   在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   3.11

   小心吸出并丢弃乙醇。在不搅动磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
   3.12

   在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
   
   
   
4. DNA酶消化
   为了从已去除RNA/球蛋白的RNA中去除杂交寡核苷酸，将样本与DNA酶一起孵育。
   注意：确保已制备了DNA酶消化反应预混液（表4），并保存在室温。
   
   4.1

   按下述方式配制DNA酶消化反应：
   
   
   

   4.2

   通过多次上下吹打彻底重悬磁珠。

   4.3

   将板/管在室温下孵育3分钟以从磁珠上洗脱RNA。

   4.4

   将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。

   4.5

   仔细将20 μl的上清液转移到一个新的板/管中。丢弃带有磁珠的板/管。

   4.6

   采用如下实验方法孵育带有上清液的板/管。
   
   
   

   4.7

   立即进行DNA酶消化纯化（步骤5）。
   
   
5. DNA酶消化纯化
   
   5.1

   结合以下方法，进行一次2.2X基于磁珠的纯化：
   
   
   
   5.2

   通过多次上下吹打彻底重悬磁珠。
   5.3

   将板/管在室温下孵育5分钟，以将RNA结合到磁珠上。
   5.4

   将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   5.5

   小心吸出并丢弃60 μl的上清液。
   5.6

   将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
   5.7

   在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   5.8

   小心吸出并丢弃乙醇。
   5.9

   将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
   5.10

   在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   5.11

   小心吸出并丢弃乙醇。在不搅动磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
   5.12

   在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
   
   
   
6. RNA洗脱、片段化和预备
   在片段化、预备和洗脱缓冲液（1X）中，将去除rRNA/球蛋白mRNA的总RNA从磁珠上洗脱，并在高温下通过孵育将其片段化成所需片段大小。
   注意：可选质控：rRNA和球蛋白mRNA的去除效率可用qRT-PCR评估，这需要过程对照物（不含RNA酶H）并遵循修改后的RNA洗脱方案。有关更多信息，请参阅原说明书附录B。
   
   6.1

   结合如下方法在室温下制备所需量的片段化、预备和洗脱缓冲液（1X）：
   
   
   

   6.2

   通过多次上下吹打，在22 μl的片段化、预备和洗脱缓冲液（1X）中，彻底重悬带有经过纯化和DNA酶处理的RNA的磁珠。

   6.3

   将板/管在室温下孵育3分钟以从磁珠上洗脱RNA。

   6.4

   将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。

   6.5

   仔细将20 μl的上清液转移到一个新的板/管中。丢弃带有磁珠的板/管。
   安全停止点: 样本可以在-15 °C至-25 °C下储存 ≤ 24小时。准备好后，继续执行步骤6.6。

   6.6

   将板/管置于热循环仪中，并按照如下方法进行片段化和预备程序：
   
   
   

   6.7

   将板/管置于冰上，立即继续进行第一条链合成（步骤7）。
   
   
7. 第一条链合成
   
   7.1

   在冰上，按照如下所述配制第一条链合成反应：
   
   
   
   7.2

   将板/管置于冰上，通过多次轻轻上下吹打进行彻底混匀。
   7.3

   采用如下实验方法孵育板/管：
   
   
   
   7.4

   将板/管置于冰上，立即继续进行第二条链合成与加A尾（步骤8）。
   
   
8. 第二条链合成与加A尾
   
   8.1

   在冰上，按照如下所述配制第二条链合成与加A尾反应：
   
   
   8.2

   将板/管置于冰上，通过多次轻轻上下吹打进行彻底混匀。
   8.3

   采用如下实验方法孵育板/管。
   
   
   
   8.4

   将板/管置于冰上，立即继续进行接头连接（步骤9）。
   
   
9. 接头连接
   
   9.1

   稀释接头准备连接，目的是获得以下浓度：
   
   
   
   9.2

   在冰上，按照下述方式设置接头连接反应：
   
   
   
   9.3

   将板/管保存在冰上，通过多次上下吹打进行彻底混匀。
   9.4

   将板/管在20 °C下孵育15分钟。
   9.5

   立即进行第一次连接后纯化（步骤10）。
   
   
10. 第一次连接后纯化
    
    10.1

    结合以下方法，进行一次0.63X基于磁珠的纯化：
    
    
    
    10.2

    通过涡旋振荡和/或多次上下吹打进行彻底混匀。
    10.3

    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    10.4

    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    10.5

    小心吸出并丢弃175 μl的上清液。
    10.6

    将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
    10.7

    在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    10.8

    小心吸出并丢弃乙醇。
    10.9

    将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
    10.10

    在室温下将板/管置于磁力架上孵育≥30秒。
    10.11

    小心吸出并丢弃乙醇。在不搅动磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
    10.12

    在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
    注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    
    10.13

    从磁力架上取下板/管。
    10.14

    在50 μl 10 mM的Tris-HCl（pH 8.0-8.5）中彻底重悬磁珠。
    10.15

    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    安全停止点：含有重悬磁珠的溶液可在2 °C至8 °C储存 ≤ 24小时。不要冰冻磁珠，因为这会导致DNA大量丢失。准备好后，进行第二次连接后纯化（步骤11）。
    
    
11. 第二次连接后纯化
    
    11.1

    结合以下方法，进行一次0.7X基于磁珠的纯化：
    
    
    
    11.2

    通过涡旋振荡和/或多次上下吹打进行彻底混匀。
    11.3

    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    11.4

    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    11.5

    小心吸出并丢弃80 μl的上清液。
    11.6

    将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
    11.7

    在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    11.8

    小心吸出并丢弃乙醇。
    11.9

    将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
    11.10

    在室温下将板/管置于磁力架上孵育≥30秒。
    11.11

    小心吸出并丢弃乙醇。在不搅动磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
    11.12

    在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
    注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    
    11.13

    从磁力架上取下板/管。
    11.14

    在22 μl 10 mM的Tris-HCl（pH 8.0-8.5）中彻底重悬磁珠。
    11.15

    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    11.16

    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    11.17

    将20 μl澄清的上清液移液到新的板/管中，并进行文库扩增（步骤12）。
    安全停止点：纯化的接头连接文库DNA可以在2 °C至8 °C下储存 ≤ 1周，或冰冻在-15 °C至-25 °C下储存≤1个月。准备好后，继续进行文库扩增（步骤12）。
    
    
12. 文库扩增
    
    12.1

    按如下方式配制每个文库扩增反应：
    
    
    
    12.2

    通过多次上下吹打进行充分混合。
    12.3

    使用以下热循环顺序扩增文库：
    
    *非标准（即除Illumina TruSeq外）接头/引物组合可能需要优化退火温度。
    
    
    12.4

    进行文库扩增纯化（步骤13）。
    
    
13. 文库扩增纯化
    
    13.1

    结合以下方法，进行一次1X基于磁珠的纯化：
    
    
    
    13.2

    通过涡旋振荡和/或多次上下吹打进行彻底混匀。
    13.3

    将板/管在室温下孵育5-5分钟以将DNA结合到磁珠上。
    13.4

    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    13.5

    小心吸出并丢弃95 μl的上清液。
    13.6

    将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
    13.7

    在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    13.8

    小心吸出并丢弃乙醇。
    13.9

    将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
    13.10

    在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    13.11

    小心吸出并丢弃乙醇。在不搅动磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
    13.12

    在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
    注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    
    13.13

    在22 μl 10 mM的Tris-HCl（pH8.0-8.5）中彻底重悬已干燥的磁珠。
    13.14

    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    13.15

    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    13.16

    将20 μl澄清的上清液转移到一个新的板/管中，可将纯化的扩增文库在2 °C至8 °C下储存 ≤ 1周，或在-15 °C至-25 °C下长期储存。
    
    

使用过本产品的部分文献

1. Dreyer, S. B., Jamieson, N. B., Evers, L., Duthie, F., Cooke, S., Marshall, J., Beraldi, D., Knight, S., Upstill-Goddard, R., Dickson, E. J., Carter, C. R., McKay, C. J., Biankin, A. V. and Chang, D. K. (2019). Feasibility and clinical utility of endoscopic ultrasound guided biopsy of pancreatic cancer for next-generation molecular profiling. Chin Clin Oncol 8(2):
2. Hyle, J., Zhang, Y., Wright, S., Xu, B., Shao, Y., Easton, J., Tian, L., Feng, R., Xu, P. and Li, C. (2019). Acute depletion of CTCF directly affects MYC regulation through loss of enhancer-promoter looping. Nucleic Acids Res 47(13): 6699-6713.
3. Lawrence, M. C., Darden, C. M., Vasu, S., Kumano, K., Gu, J., Wang, X., Chan, J., Xu, Z., Lemoine, B. F., Nguyen, P., Smitherman, C., Naziruddin, B. and Giuliano, T. (2019). Profiling gene programs in the blood during liver regeneration in living liver donors. Liver Transpl.
4. Li, W., Wei, D., Liang, J., Xie, X., Song, K. and Huang, L. (2019). Comprehensive Evaluation of white matter damage and neuron death and whole-transcriptome analysis of rats with chronic cerebral hypoperfusion. Front Cell Neurosci 13: 310.
5. Marggraf, M. B., Panteleev, P. V., Emelianova, A. A., Sorokin, M. I., Bolosov, I. A., Buzdin, A. A., Kuzmin, D. V. and Ovchinnikova, T. V. (2018). Cytotoxic potential of the novel horseshoe crab peptide polyphemusin III. Mar Drugs 16(12).
6. O'Connell, C. M., Brochu, H., Girardi, J., Harrell, E., Jones, A., Darville, T., Sena, A. C. and Peng, X. (2019). Simultaneous profiling of sexually transmitted bacterial pathogens, microbiome, and concordant host response in cervical samples using whole transcriptome sequencing analysis. Microb Cell 6(3): 177-183.
7. Suntsova, M., Gaifullin, N., Allina, D., Reshetun, A., Li, X., Mendeleeva, L., Surin, V., Sergeeva, A., Spirin, P., Prassolov, V., Morgan, A., Garazha, A., Sorokin, M. and Buzdin, A. (2019). Atlas of RNA sequencing profiles for normal human tissues. Sci Data 6(1): 36.