摘要:为了提高分离效率,采用两步法进行肌肉干细胞的分离和分选。首先分离小鼠骨骼肌,并将肌肉组织消化为单细胞悬液。然后利用流式分选的方法,使用杂细胞标签CD45、CD31和Sca I进行负筛后,再使用VCAM1进行阳性筛选,从而获得高纯度肌肉干细胞。采用此方法获得的肌肉干细胞可直接用于各种测序或进行细胞培养。
关键词: 骨骼肌, 肌肉干细胞, VCAM1
材料与试剂
- 10 cm dish
- 培养皿
- 离心管
- 封口膜
- 移液管
- 10 ml注射器
- 20 G针头
- 40 μm滤膜
- FACS管
- 小鼠
- 马血清 (Hyclone, catalog number: SH30074.03)
- Collagenase II (Worthington, catalog number: LS004177)
- Dispase (Life Technologies, catalog number: 17105-041)
- CD31-APC (Clone MEC13.3, BioLegend, catalog number: 102510, 4 °C)
- CD45-APC (Clone 30-F11, BioLegend, catalog number: 103112, 4 °C)
- Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Anti-Sca1,clone D7, BioLegend, catalog number: 108120, 4 °C)
- Biotin anti-mouse CD106 (Anti-vascular cell adhesion molecule 1 (anti-VCAM 1),clone 429, BioLegend, catalog number: 105704, 4°C)
- F-10 (Gibco, catalog number: 11550-043)
- Penicillin-streptomycin mixture (Hyclone, catalog number: SV10030)
- PE/Cy7 streptavidin (BioLegend, catalog number: 405206, 4 °C)
- 乙醇
- PI
- Wash medium (WM) (见溶液配方)
- Muscle dissociation buffer (MDB) (见溶液配方)
- Stock collagenase II solution (见溶液配方)
- Stock dispase solution (见溶液配方)
仪器设备
- 移液枪
- 眼科剪
- 尖头镊子
- 手术刀
- ZWY恒温水浴培养振荡器 (上海智城分析仪器制造有限公司,model: ZWF-110X30)
- 水平离心机 (Thermo Scientific,model: labofuge 400 R)
- 高速流式细胞分选仪-Aria Sorp (BD,FACS Aria SORP)
实验步骤
一、肌肉解剖 (15~20 min/只小鼠,6周龄~28月龄均可)
- 一只小鼠准备一个10 cm dish,在每个10 cm dish中加入10 ml WM。
- 将小鼠安乐死。
- 将小鼠尸体用70%乙醇喷湿,腹部朝上放在解剖台上。
- 用镊子夹起脚踝周围的皮肤,剪一个小切口。
- 剥开腿部皮肤,使后腿肌肉全部暴露出来,如图1所示。
图1. 小鼠后肢骨骼肌
- 取下所有后腿肌肉,放入准备好的10 cm dish中,并剔除肌间脂肪。
- 如果实验需要也可将前肢的三头肌解剖下来。
- 将肌肉转移至一个新的培养皿中,用镊子固定肌肉的一端,然后用手术刀将肌肉切成薄片。这一步骤应在10 min内完成。
注:此步骤目的在于尽可能增加肌肉组织与消化液的接触面积,提高消化效率。
二、分离单核细胞
- 将切好的薄片状肌肉组织转移至50 ml离心管中,加入10 ml MDB。
注:一个离心管内最多放置两只小鼠的肌肉量,即20 ml MDB。 - 用封口膜将离心管封好,水平固定在37 °C恒温水浴摇床上 (平行于摇床运动方向,并完全浸没于水中),60~70 rpm,1 h。
- 在每个离心管中加入预冷的WM至50 ml,轻柔地上下颠倒混匀。
- 用水平离心机4 °C 500 x g离心5 min。弃上清,在管底留8 ml。
- 加入1 ml stock collagenase II solution和1 ml stock dispase solution。
- 用5 ml移液管将沉淀重悬,吹吸10~15次或吹吸至没有阻力即可。
- 用封口膜将离心管封好,水平固定在37 °C恒温水浴摇床上 (平行于摇床运动方向,并完全浸没于水中),60~70 rpm,30 min。
- 用10 ml注射器和20G的针头吹吸十次。
注:将液体吹到管壁上,避免气泡。 - 在每个离心管中加入预冷的WM至50 ml,轻柔地上下颠倒混匀。
- 用水平离心机4 °C 500 x g离心5 min。弃上清,在管底留10 ml。
- 取一个干净的50 ml离心管,准备好40 μm滤膜。
- 用10 ml的移液管把沉淀重悬,自然过滤。
- 在沉淀管里加10 ml WM,清洗离心管后过滤。
- 另取10 ml WM冲洗滤膜。用200 μl的移液枪将滤膜底部残留的液体转移到离心管里。
- 在每个离心管中加入预冷的WM至50 ml,轻柔地上下颠倒混匀。
- 用水平离心机4 °C 500 x g离心5 min。立刻彻底吸干上清。
注:不要吸到沉淀。 - 用600 μl WM 重悬细胞沉淀,计数。约8~12 x 106个细胞/只小鼠。
三、 染色
- 在5 ml的FACS管中加入190 μl WM,取10 μl细胞悬液放入其中,作为未染样品。
- 取3个1.5 ml离心管,做好标记,每管中加入190 μl WM和10 μl细胞悬液。按照表1进行染色 (作为单染样品):
表1. 单染样品染色
- 将剩余所有细胞悬液转移至一个1.5 ml离心管中 (即实验组),加入抗体VCAM1、CD31、CD45、Sca1,各5 μl/只小鼠。
- 将所有的样品固定在rocker上,最低转速,4 °C,40 min。
- 每管加WM至1.5 ml,轻柔地上下颠倒数次混匀。用固定角转子4 °C 250 x g离心5 min。
- 彻底弃上清,单染组用200 μl WM 重悬细胞沉淀,实验组用500 μl WM重悬。
- 在VCAM1单染组细胞中加入0.5 μl PE/Cy7。
- 在实验组细胞中加入5 μl PE/Cy7和1 μl PI (PI终浓度为0.3 μg/ml)。将所有的样品固定在rocker上,最低转速,4 °C,20 min。
- 将除VCAM1单染管外的其他单染管置于冰上避光备用。
- 在染了PE/Cy7的每个离心管中加入WM至1.5 ml,轻柔地上下颠倒数次混匀。用固定角转子4 °C 250 x g离心5 min。
- 彻底弃上清,VCAM1单染组用200 μl WM 重悬细胞沉淀,并40 μm过滤后转移至5 ml的FACS管中。
- 实验组用500 μl WM 重悬,并40 μm过滤后转移至5 ml的FACS管中。
- 另取500 μl WM 冲洗实验组的1.5 ml离心管,将洗涤液同样40 μm过滤后转移至5 ml的FACS管中,注意将滤膜上的残液吸净。然后再取1 ml WM 加入FACS管中,轻柔混匀。
四、分选
- 选用70 μm喷嘴。
- 调电压。
- 上单染组样品,调补偿,确保阳性群清晰。
- 用15 ml的离心管装5 ml WM收集CD31−CD45−Sca1−VCAM+的细胞群,如图2所示。
图2. CD31−CD45−Sca1−VCAM+的细胞群分选. A. P5为CD31−CD45−Sca1−的细胞群。B. P6为CD31−CD45−Sca1−VCAM+的细胞群。C. CD31−CD45−Sca1−VCAM+的细胞群在单核细胞混合悬液中占比4.0%。
注意事项
- 从小鼠安乐死到肌肉切成薄片放入MDB中,全程最好保证15 min内完成。
- 肌肉组织要保证切成均匀的薄片,否则消化不彻底会造成肌肉干细胞损失。
- 消化过程中注意观察,待消化至无片状组织后,及时终止消化,否则会导致肌肉干细胞死亡。
溶液配方
- Wash medium (WM)
F-10 + 10%HS (horse serum,马血清)
1x PS (青霉素-链霉素双抗),冰上备用 - Muscle dissociation buffer (MDB)
700~800 U/ml collagenase II溶液 (溶剂为WM) 10 ml/只小鼠
现用现配,冰上备用 - Stock collagenase II solution
将collagenase II粉末溶于1x PBS至终浓度1,000 U/ml
0.22 μm过滤,分装成1 ml/tube,-20 °C保存 - Stock dispase solution
将dispase粉末溶于1x PBS至终浓度11 U/ml
0.22 μm过滤,分装成1 ml/tube,-20 °C保存,三个月内用完
致谢
感谢香港科技大学Tom H Cheung博士共同讨论肌肉干细胞分选方法。感谢中国科学院生物化学与细胞生物学研究所细胞平台的边玮、王雪冬、丁宇波、俞珺璟老师在分选仪器使用中的帮助。感谢中国科学院器官重建与制造战略性先导科技专项 (XDA16021400),科技部重点研发计划 (2017YFA002700),自然科学基金委员会(91649104,31671536),NN-CAS Foundation,上海市科委 (Y753S11802,18ZR1446300) 的资助。
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