A brief version of this protocol appeared in:
Advertisement

Navigate this Article


 

The Detection of Specific B Cell Immune Response by Flow Cytometry   

How to cite Favorites Q&A Share your feedback Cited by

摘要:B 细胞主要通过呈递抗原和产生抗体在自身免疫病的发生、发展中发挥重要作用,研究抗原特异性的B细胞免疫反应非常重要,但是对于特异性B细胞免疫反应的检测非常困难,于是我们根据B细胞上的BCR可以识别Qb抗原的特性,利用Qb-AF647富集到抗原特异性B细胞。由于流式细胞仪是使细胞以单个方式依次通过探测光束,并采集细胞被光照时产生的各种信号,并能对多个荧光参数进行关联分析的一种仪器,所以我们对富集后的抗原特异性B细胞通过流式细胞仪进行检测。

关键词: B细胞, 流式细胞染色, 流式细胞仪


材料与试剂

  1. 5 ml 流式管
  2. 枪尖若干:2 µl、20 µl、100 µl、200 µl 和 1 ml
  3. 40 μm和70 μm过滤筛
  4. U型底96孔板
  5. 六孔板
  6. 15 ml、50 ml离心管
  7. 1 ml带针注射器
  8. 可放置5 ml流式管的试管架2~3个
  9. 解剖工具和烧杯
  10. Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 MicroBeads (Miltenyi, catalog number: 130-091-395)
  11. LS Separation columns (Miltenyi, catalog number: 130-042-401)
  12. 小鼠 (C57BL/6小鼠,雌雄不限,8周以上,数量根据实验需求安排)
  13. DNase I 10 mg/ml (Worthington, catalog number: LS002140,溶剂为20 mM Tris,1 mM MgCl2,PH7.5)
  14. Collagenase 4,000 U/mg (Worthington, catalog number: LS004177,溶剂为PBS)
  15. Qb-AF647 (荧光蛋白) [Qb为实验室自行表达纯化,用AF647标记试剂盒 (Invitrogen, catalog number: A20173) 标记Qb,合成Qb-AF647]
  16. Anti-CD16/32抗体 (Bioxcell, catalog number: BE0307)
  17. 大鼠血清
  18. 流式抗体 (表1)

    表1. 流式抗体详细信息


  19. PBS溶液和蒸馏水 (0.22 µm滤膜过滤)
  20. RPMI-1640 (HyClone, catalog number: SH30809.01)
  21. HEPES 25 mM PH 7.4 (Sigma-Aldrich, catalog number: H3375,溶剂为ddH2O)
  22. FCS
  23. EDTA
  24. NaN3
  25. Tris
  26. MgCl2
  27. NaOH
  28. 消化液 (见溶液配方)
  29. FC block (见溶液配方)
  30. FACS 缓冲液 (见溶液配方)
  31. 0.5 M EDTA (见溶液配方)

仪器设备

  1. 10 µl、200 µl、1,000 µl移液枪
  2. 12通道200 µl排枪
  3. 磁力架 (Miltenyi)
  4. 台式冷冻离心机 (Thermo, model: LEGEND RT+)
  5. 恒温培养箱 
  6. 旋转仪
  7. 细胞颗粒计数仪 (Beckman, model: Coulter Z2)
  8. 旋涡混匀器 (配抗体mix)
  9. 水浴锅
  10. 高压蒸汽灭菌锅
  11. BD FACS 流式细胞仪 (BD, model: BD LSRFortessa),配置 3B-6V-4YG-3R-2UV (表2)

    表2. 流式细胞仪激光器配置信息

实验步骤

一、收集细胞

  1. 收集所有淋巴结 (腹股沟、腋窝、臂) 或脾脏 (具体操作步骤详见视频1~2),放在6孔板中,每孔含1 ml消化液。
    注:如果同时分离淋巴结和脾脏,将淋巴结和脾脏分成两个孔。

    视频1. 收集淋巴结步骤










    视频2. 收集和解剖脾脏步骤

  2. 对于脾脏,先用1 ml带针注射器吸取孔中消化液冲洗脾细胞,然后用手术刀片将组织切碎,组织块应能通过1 ml移液管尖端的孔,将细胞吹打至无可见团块。并将细胞转移到15 ml离心管中,再向孔中加入4 ml消化液冲洗该孔,并合并到同一管中。对于淋巴结,用手术刀片将组织切碎,并将细胞转移到15 ml离心管中,再向孔中加入4 ml消化液冲洗该孔,并合并到同一管中。
  3. 将离心管在37 °C水浴中孵育5分钟,然后在37 °C培养箱中以大约20转/分的速度旋转20分钟 (总共25分钟的消化时间)。这一步骤对于从淋巴结和脾脏中取出血浆细胞至关重要。
    注:未消化的细胞含有更多的非特异性细胞,这些细胞将与抗AF647磁珠结合。
  4. 向每管中加入100 μl 0.5 M EDTA,并用移液枪吹散细胞聚集物。在37 °C培养箱下以大约20转/分的速度再旋转5分钟。
  5. 在50 ml离心管口放置70 μm细胞过滤筛。将消化后的细胞悬浮液倒在细胞筛上,并用注射器栓塞将剩余的组织捣碎,使之通过细胞筛。用FACS缓冲液先将消化管冲洗干净,再用FACS缓冲液冲洗细胞筛,之后用FACS缓冲液将最终体积调至40 ml,翻转50 ml离心管至细胞均匀。
  6. 细胞计数。
    注:请根据实验室具体设备情况,选择相应计数方法。
  7. 以455 x g的转速在4 °C下离心细胞5分钟,尽可能地倒出上清液。轻敲细胞颗粒使之完全松散。加入200 μl Fc Block,重新悬浮。在冰上孵育5分钟,然后进入下一步。

二、QB-AF647染色 (Hua和Hou,2013)
  1. 加入1 μl Qb-AF647 (1.0 μg/μl,标记率10~20%)。每个样品加入1 μg Qb-AF647,轻轻敲击和晃动,混合均匀。在4 °C冰箱中避光染色30分钟。
  2. 用20 ml FACS缓冲液冲洗细胞,然后以311 x g的速度4 °C离心5分钟。倒出上清液;轻敲细胞颗粒使之完全松散。
  3. 向细胞中加入200 μl FACS缓冲液,并用移液器使之重新悬浮。
  4. 加入15 μl Anti-Alexa647磁珠,混合均匀,4 °C孵育15分钟。
  5. 用40 ml FACS缓冲液清洗细胞,然后离心 (455 x g,5分钟4 °C)。

三、MACS富集 (Hua和Hou,2013)
  1. 在Midimacs磁铁上放置一个Mitenyl LS柱,并用3 ml FACS缓冲液进行预冲洗,弃废液。在柱下放置一个新的15 ml离心管。
  2. 倒出细胞离心后的上清液,将细胞颗粒重新悬浮在3 ml FACS缓冲液中,并用40 μm细胞筛过滤。将过滤后细胞加入LS柱中,至细胞通过LS柱后,立即加入3 ml FACS缓冲液冲洗LS柱。
  3. 停止滴水后,将LS柱从磁铁上取下,放在一个新的15ml 离心管上。
  4. 向LS柱中加入5 ml FACS缓冲液,用活塞一次推动缓冲液通过。
  5. 离心收集细胞 (311 x g,5分钟,4 °C离心)。用100 μl FACS缓冲液重新悬浮细胞。
  6. 细胞计数。
    注:请根据实验室具体设备情况,选择相应计数方法。
  7. 根据细胞计数结果,取1 x 106细胞在96孔U型板中。

四、样品染色 (表3)

        表3. 流式染色配置方案

  1. 按照以上染色方案预先配制好抗体单染管和样品管溶液,离心96孔板 (863 x g, 1分钟,4 °C),除去上清液,轻轻拍打板两侧使细胞颗粒松动;
  2. (可选)对于小鼠来源的单克隆抗体染色,或对于可能受染色抗体的FC段结合影响的弱信号,用0.5 μg纯化的anti-CD16/32单克隆抗体 (最终10 μg/ml) 在4 °C下阻断Ig-fc受体 (fcr) 15分钟;
  3. 将Un-stain管细胞重新悬浮在50 μl/孔FACS缓冲液中;其余单染管和样品管分别加入50 μl预先配制好已加入抗体的单染管和样品管溶液,4 °C避光染色30分钟;
  4. 在每个孔中加入200 μl的FACS缓冲液,以清洗细胞;
  5. 离心96孔板 (863 x g,1分钟,4 °C),除去上清液,轻轻拍打板两侧使细胞颗粒松动;
  6. 再次重复清洗步骤。
  7. 向细胞中加入200 μl的FACS缓冲液,并将所有细胞转移到冰上的流式上机管中。

五、上机检测流程
  1. 依次创建 New Folder> Experiment > Specimen > Tube。
  2. 在 Parameters 窗口中保留:Alexa Fluor 647、PE-CF594、PE-Cy7、BV711、AF700、APC-Cy7、PE、PerCP-Cy5.5。
  3. 在菜单栏中选择 Experiment > Compensation Setup> Create Compensation Controls,点击 OK。自动生成名称为 Compensation Control 的 Specimen,包含阴性对照管及各单染补偿管。
  4. 上阴性对照管,调节 FSC/SSC 电压,使 P1 门圈中样本群,单击右键,将 P1 门应用到所有补偿对照管。
  5. 将各单染管依次上样,调整电压,确认阳性群低于各荧光通道的最高检测范围。
  6. 依次记录各单染管,重新命名补偿名称,并链接应用补偿,记录样本管。

结果与分析

实验结果见图1。


图1. 小鼠和Qb-VLP免疫的脾脏细胞富集及检测结果. A. 用Qb-AF647分别标记来自naïve 小鼠和Qb-VLP免疫12天的脾脏细胞,并用磁珠富集。B. 从Qb-VLP免疫14天小鼠的脾脏细胞富集Qb-AF647+ 细胞,进一步将其分为GC B细胞和PCs (Liao等,2017)

失败经验

  1. 使细胞和所用到的缓冲液和试剂尽可能地保持在冰上。
  2. 细胞离心后,请用力拍打96孔板以致细胞颗粒松散。
  3. 96孔U型板需要移液时尽量用排枪,以免加错孔。
  4. 操作过程动作轻柔,尽量避光,于冰上操作;排枪加样、混匀时应小心细致,防止样品污染。

溶液配方

  1. 消化液
    RPMI-1640
    25 mM HEPES pH7.4 (来自1 M原液)
    胶原酶II 200 u/ml (来自4,000 u/ml原液)
    DNase I 100 μg/ml (来自10 mg/ml原液)
    新鲜制备,每个样品5 ml,准备收集细胞时预热至37 °C
  2. FC block
    100 μg/ml的anti-CD16/32抗体
    2% 大鼠血清
    溶于FACS缓冲液 (制备200 μl/样品)
  3. FACS缓冲液
    2% FCS
    2 mM EDTA
    0.1% NaN3
    溶于PBS (预冷)
  4. 0.5 M EDTA
    将18.6 g EDTA·2H2O溶于80 ml超纯水中
    用NaOH调PH值至8.0,并高温高压灭菌
    最终调整至10 mM

致谢

侯百东实验室的工作得到中国科学院,国家自然科学基金和国家科技重大专项的支持。本文实验方案改编自本实验室的发表文章Liao等(2017) 和Hua和Hou (2013)。

参考文献

  1. Hua, Z. and Hou, B. (2013). TLR signaling in B-cell development and activation. Cell Mol Immunol 10(2): 103-106.
  2. Liao, W., Hua, Z., Liu, C., Lin, L., Chen, R. and Hou, B. (2017). Characterization of T-dependent and T-independent B cell responses to a virus-like particle. J Immunol 198(10): 3846-3856.
Please login or register for free to view full text
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:刘懿蕃, 华兆琳, 侯百东. (2019). 特异性B细胞免疫反应的流式检测. Bio-101: e1010344. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010344.
How to cite: Liu, Y. F., Hua, Z. L. and Hou, B. D. (2019). The Detection of Specific B Cell Immune Response by Flow Cytometry. Bio-101: e1010344. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010344.
Q&A

If you have any questions/comments about this protocol, you are highly recommended to post here. We will invite the authors of this protocol as well as some of its users to address your questions/comments. To make it easier for them to help you, you are encouraged to post your data including images for the troubleshooting.

If you have any questions/comments about this protocol, you are highly recommended to post here. We will invite the authors of this protocol as well as some of its users to address your questions/comments. To make it easier for them to help you, you are encouraged to post your data including images for the troubleshooting.

We use cookies on this site to enhance your user experience. By using our website, you are agreeing to allow the storage of cookies on your computer.