Cytometric Beads-based Immunoassays to Quantify Multiple Soluble Analytes   

材料与试剂

1. Beads
2. 1.5 ml EP管
3. 各种规格Tip头
4.  排枪加样槽
5. 无菌水
6. SA-PE
   流式多因子检测试剂 (根据需要选择或个性化定制)：
7. Assay Buffer 
8. Wash Buffer
   

仪器设备

1. 流式细胞仪 (BD FACSCalibur, BD FACSCanto, BD LSRFortessa等均可，理论上含SSC，APC，PE检测通道的即满足使用)
2. 涡旋振荡仪 (WIGGENS, model: Vortex3000)
3. 水平离心机 (Thermo Scientific, model: Sorvall ST 40)
4. 移液器 (Eppendorf 0.5~10 μl, 20~200 μl, 100~1,000 μl, 200~2,000 μl 8通道排枪)
   

实验步骤

一.试剂准备

1. Beads准备
   将所需Beads剧烈涡旋1 min使Beads充分混匀。计算Beads用量。每个反应25 μl。根据反应用量，用Assay Buffer稀释。
   注：对于未预混的Beads，需要自行配制工作浓度：配制前先涡旋3 min，根据所需要反应数计算用量总体积，总体积/13等于单个因子用量，单个因子用量 x 因子数 = beads体积，总体积 - beads体积 = 加入Assay Buffer体积。举例：5因子试剂盒做50个反应需1.5 ml工作浓度预混bead，每个因子beads (13x) 需要115 μl (总beads体积是575 μl)，加入925 μl Assay Buffer，涡旋混匀即可。
2. Wash Buffer准备
   将20 x WB放置室温，使其中盐分充分溶解，用蒸馏水将其配成1 x WB。
3. 标准品准备
   用250 μl Assay Buffer溶解Standard，颠倒多次使其充分混匀，静止10 min, 然后移入EP管中，标记为C7。另取7个EP管，分别标记为C6/C5/C4/C3/C2/C1/C0，每个管中加75 μl Assay Buffer, 4倍比稀释，从C7中取出25 μl进行梯度稀释，直到稀释到C1为止，C0为Assay Buffer (如图2)，-80 °C储存一个月。
   
   
   图2. 标准品准备
   
   
4. Mitrix B准备
   用5 ml Assay Buffer溶解Mitrix B，颠倒多次使其充分混匀，静止15 min以保证粉末充分溶解，-80 °C储存一个月。

1. 试剂盒中组分恢复至室温。
2. 检测过程：
   2.1

   检测血清血浆样本：
   样品准备：血清血浆样本，需使用Assay buffer稀释一倍 (50 μl样本 + 50 μl Assay buffer)。
   加25 μl Assay Buffer到各样品管。
   加 25 μl Mitrix B 到各标准品管。
   加25 μl各标准品到相应标准品管。
   加25 μl各样品到相应样品管。
   加25 μl混合beads到各管。
   加25 μl检测抗体到各管。
   注：在加Beads时，避免Beads沉降，每管的终体积为100 μl。
   2.2

   检测细胞培养上清样本 (无Matrix B)：
   加25 μl Assay Buffer到各管。
   加25 μl各标准品到相应标准品管。
   加25 μl各样品到相应样品管。
   加25 μl混合beads到各管。
   加25 μl检测抗体到各管。
   注：在加Beads时，避免Beads沉降，每管的终体积为100 μl。
3. 避光，1,000 rpm震荡EP管，RT孵育2 h。
4. 加25 μl SA-PE到各管。
   注：使用前轻柔涡旋混匀，短时离心。
5. 避光，1,000 rpm震荡EP管，RT 30 min。
6. 1,000 x g离心5 min。
7. 用枪头小心吸弃上清125 μl。注意勿吸除Beads，尽可能去除液体。
8. 每管加200 μl 1 x WB。涡旋Beads，1,000 x g离心5 min，弃上清。
9. 每管加200~300 μl 1 x WB。涡旋Beads。
10. 将Beads转移至流式管，准备流式上机。

1. 开机检查运行情况。
2. 设置数据收集文件模板。
   2.1

   在BD FACSDiva软件上创建新的模板，Experiment>New Experiment。
   2.2

   打开Worksheet，创建“dot plot”，X轴为FSC，Y轴为SSC, 二者为线性模式；创建两个门：Bead A和Bead B。
   2.3

   新建两个点状图，均以PE为X轴，APC为Y轴，分别显示上述两个门，数据显示应为log模式。
3. 设置PMT电压
   3.1

   震荡混匀Raw Beads，分装400 μl Raw Beads到FACS管。
   3.2

   机器流速设为low，运行，确保可见两群Beads (A和B)。
   3.3

   继续调试，确保A和B分离完全，且FSC和SSC读值大于50 (x1,000)。
   3.4

   调整Bead A和Bead B门范围，确保将群覆盖。
   3.5

   调整FITC设置，以确保多数Beads介于10e1~10e2之间。
   3.6

   调整PE设置，以确保多数Beads介于10e1~10e2之间。
   3.7

   调整APC设置，确保所有Beads的荧光强度在1 x 10e2~5 x 10e4之间。
   3.8

   保存设置，准备样品上机。

1. 调试完成后，打开文件模板，设置每个分析物收集数：300左右。比如8个因子，Beads数目应该至少收集2,400个。
2. 震荡样品，待机器稳定上样，设置机器流速为Low。数据导出，软件分析。
   

结果与分析

人外周血单核细胞 (PBMC) 分别用LPS和CD3/CD28 (1 μg/ml) 刺激2 d和4 d，收集细胞培养上清，检测13种细胞因子的表达量 (浓度单位：pg/ml) 变化 (图4)。


图4. PBMC刺激后培养上清13种细胞因子表达水平

失败经验

1. 微球分群不均一
   可能微球未充分混匀。微球容易沉积，使用之前必须充分涡旋。样品较多微球加样时，为防止微球沉积，应该每隔一段时间 (例如每加2~3列) 再次短暂涡旋混匀。
2. 标准曲线不理想
   可能为样品交叉污染。加样时应严格防止交叉污染，例如标准品从低浓度至高浓度最后加样，优先用排枪加入共同的组分等。
3. 碎片信号过多
   上调FSC和SSC的阈值。如果在调整阈值以后问题依然存在，可重复样品的洗涤步骤或者再次稀释样品。
4. 检测结果值偏低
   样本避免反复冻融，冻融会导致蛋白降解。
   

致谢

本工作得到解放军总医院第五医学中心和中国科学院生物物理研究所的支持。本文实验方案改编自本团队的已发表文章 (Ma等，2014和Zhang等，2018)。

参考文献

1. Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang W. and Ji, S. (2017). Multiplex cytokine profiling of stimulated mouse splenocytes using a cytometric bead-based immunoassay platform. J Vis Exp 129: e56440.
2. Ma, F., Feng, J., Zhang, C., Li, Y., Qi, G., Li, H., Wu, Y., Fu, Y., Zhao, Y., Chen, H., Du, J. and Tang, H. (2014). The requirement of CD8+ T cells to initiate and augment acute cardiac inflammatory response to high blood pressure. J Immunol 192(7): 3365-3373.
3. Zhang, C., Feng, J., Du, J., Zhuo, Z., Yang, S., Zhang, W., Wang, W., Zhang, S., Iwakura, Y., Meng, G., Fu, Y. X., Hou, B. and Tang, H. (2018). Macrophage-derived IL-1α promotes sterile inflammation in a mouse model of acetaminophen hepatotoxicity. Cell Mol Immunol 15(11): 973-982.