Detection of Nuclear Ploidy by Flow Cytometry   

材料与试剂

1. 枪头
   
2. 刀片 (蓝吉列)
   
3. 400目滤膜 (国产)
   
4. 锡箔纸
   
5. 2 ml离心管
   
6. 柠檬酸
   
7. Tween 20
   
8. Na₂HPO₄·12H₂O
   
9. Tris
   
10. Na₂EDTA
    
11. 四盐酸精胺
    
12. KCl
    
13. NaCl
    
14. Triton X-100
    
15. β-巯基乙醇
    
16. RNase
    
17. 细胞核分离缓冲液 (见溶液配方)
    
18. PI染液 (见溶液配方)
    
19. DAPI染液 (见溶液配方)
    注：本实验所用试剂均为进口试剂。
    

仪器设备

1. 移液枪
   
2. 离心机
   
3. 流式细胞仪 (Backman)
   

实验步骤

1. 准备实验材料：根据需要选用发芽10 d左右的幼苗，或状态良好的愈伤。
   
2. 配所需试剂 (所有试剂均用进口)：
   2.1

   细胞核分离缓冲液 (溶液配方1)
   
   2.2

   PI染液 (见溶液配方2)
   
   2.3

   DAPI染液 (见溶液配方3) 
3. 将叶鞘或愈伤浸没在600 μl解离液Otto I buffer中，在冰上用刀片尽可能细地切碎，室温孵育5-10 min，用400目的细胞筛过滤到2 ml离心管中，置冰上；可以再2,000 rpm离心3 min，弃上清，再加400 μl Otto I buffer重悬细胞10 min，再加入1,000 μl Otto II buffer。
   
4. 切根时将根浸没在600 μl解离液B中，在冰上用刀片小心地切靠近根尖的区段，室温孵育5-10 min，用400目的细胞筛过滤到2 ml离心管中，置冰上。
   
5. 加入PI或者DAPI染液20 μl，避光染10 min。
   
6. 移至上样管，立即上机检测。收集20,000个颗粒。
   
7. 结果分析：通常在野生型材料中可以看到碎片峰(不对称)，2C的峰(对称)，以及少量4C的峰，而在一些突变体材料中可能看到显著的4C、8C或者更高倍数的峰。
   

注意事项

解离液和材料的用量可根据材料中核的多少而适量增减，例如愈伤中核多可适量少用些材料，而根中核较少所以可适量少加些解离液，尽量保证解离液中较高的核浓度。选择合适的解离液，不合适的解离液可能导致很高的碎片峰。取材要新鲜。

溶液配方

注：所有试剂均用进口。

1. 细胞核分离缓冲液
   1)

   适用于从叶鞘或愈伤中分离
   Otto I buffer：0.1 M柠檬酸，0.5% (v/v) Tween 20，pH 2.3，4 °C保存
   Otto II buffer：0.4 M Na₂HPO₄·12H₂O，pH 8.9，常温保存
   
   2)

   适用于从根中分离
   15 mM Tris，2 mM Na₂EDTA，0.5 mM四盐酸精胺，80 mM KCl，20 mM NaCl，0.1% (v/v) Triton X-100，15 mM β-巯基乙醇，pH 7.0-8.0，-20 °C保存
2. PI染液
   母液浓度为1 mg/ml (20x)，使用浓度为50 μg/ml，用锡箔纸包裹4 °C保存。使用前加入RNase，50 μg/ml
   
3. DAPI染液
   工作浓度6 μg/ml，使用前加入RNase，50 μg/ml