RNA in-situ Hybridization   

材料与试剂

1. 进口离心管 (RNase-free)
   
2. A4纸
   
3. 切片盒
   
4. 载玻片
   
5. 手帕 (普通无尘手帕，用于拭去载玻片表面灰尘)
   
6. 玻璃瓶
   
7. 纸盒
   
8. 面巾纸
   
9. Parafilm
   
10. 无水乙醇
    
11. 二甲苯
    
12. 石蜡
    
13. 碱水
    
14. DEPC-H₂O
    
15. 0.1% poly-L-lysine溶液 (Sigma或生工，RNase free)
    
16. Tris饱和的苯酚
    
17. 氯仿(CHCl₃)
    
18. NaAc
    
19. DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Roche, catalog number: 1 175 025)
    
20. DIG Wash and Block Buffer Set (Roche, catalog number: 1 585 762)
    
21. DNase I (Invitrogen，catalog number: 18068-015)
    
22. EDTA
    
23. LiCl
    
24. 冰乙酸
    
25. NcoI酶 (可根据需要选择其他内切酶)
    
26. SP6转录酶
    
27. SalI酶 (可根据需要选择其他内切酶)
    
28. T7转录酶
    
29. Glycine
    
30. 甲醛
    
31. Tris base
    
32. 浓盐酸
    
33. EDTA-2Na
    
34. NaOH
    
35. MgCl₂·6H₂O
    
36. NaCl
    
37. NaH₂PO₄
    
38. Na₂HPO₄
    
39. Yeast tRNA (Invitrogen, catalog number: 15401029)
    
40. Proteinase K buffer
    
41. Proteinase K (Invitrogen, catalog number: 25530049)
    
42. PBS
    
43. 去离子甲酰胺
    
44. BSA
    
45. Triton X-100
    
46. 50% FAA固定液 (见溶液配方)
    
47. 70% FAA固定液 (见溶液配方)
    
48. 1 M Tris-HCl (pH 7.5) (见溶液配方)
    
49. 1 M Tris-HCl (pH 9.5) (见溶液配方)
    
50. 0.5 M EDTA-2Na pH 8.0 (见溶液配方)
    
51. 1 M MgCl₂ (见溶液配方)
    
52. 5 M NaCl (见溶液配方)
    
53. 20x SSPE pH 7.4 (见溶液配方)
    
54. 10x PBS pH 7.4 (见溶液配方)
    
55. 50%硫酸葡聚糖(Detran sulfate) (见溶液配方)
    
56. 10 mg/ml yeast t-RNA (见溶液配方)
    
57. Proteinase K buffer (见溶液配方)
    
58. 10x Hybridization salts (见溶液配方)
    
59. Prehybridization solution (见溶液配方)
    
60. 1x Blocking buffer (见溶液配方)
    
61. BSA washing buffer (见溶液配方)
    
62. TNM-50 buffer (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 脱蜡缸
   
2. 镊子
   
3. 剪刀
   
4. 镊子
   
5. 切片机
   
6. 展片台
   
7. 烘箱
   
8. 超净工作台
   
9. 紫外分光光度计
   
10. -20 °C冰箱
    
11. 冷冻离心机
    

实验步骤

1. 取材、固定、脱水、包埋、切片
   注：所有用到的玻璃器皿要洗净，并180 °C烘6 h，载玻片先用95%乙醇浸泡、擦干净，再180 °C烘6 h；所用的试剂瓶需事先装DEPC-H₂O灭过菌；所用的固定液、乙醇溶液等都要用DEPC-H₂O配制。
   1.1

   配制FAA固定液(见溶液配方)
   
   1.2

   取材：将所需材料尽量剪小，加入预冷的FAA固定液中，固定液体积应不少于材料体积的10倍。固定液放冰上，抽真空15 min，缓慢放气，再重复两次，直到材料沉底。
   
   1.3

   固定：将抽完真空的固定液吸走弃去，换成新的固定液。4 °C固定24 h。
   
   1.4

   脱水：如果是用50% FAA固定，先用50%乙醇洗掉固定液，换三次，每次30 min；如果是用70% FAA固定，先用70%乙醇洗掉固定液，换三次，每次30 min。然后梯度乙醇脱水(4 °C)：
   
   
   1.5

   继续脱水和透明(室温)
   
   
   1.6

   浸蜡
   
   
   1.7

   包埋
   预先折好纸盒，并在电磁炉上熔化新的石蜡，置于60 °C温箱中备用，注意包埋蜡温度不要过高，以免烫坏组织。包埋时，先铺一层包埋蜡，再将玻璃瓶中的材料倒进纸盒中，镊子稍加热，均匀排列材料 (动作尽可能迅速，尤其是包埋蜡之后应尽快进行后续操作)。让材料自然冷却，可第二天再收。蜡块4 °C可以保存很久。注意包埋蜡不要倒太多，蜡块厚度以1-2 cm为宜，太厚不好切片。纯蜡的温度可以提升至63 °C，防治操作过程中不迅速蜡块冷却凝固。
   
   1.8

   切片前的准备
   切片盒先用碱水浸泡过夜，然后用DEPC·H₂O洗净，42 °C烘干。
   用于原位杂交的载玻片必须保证无RNase，我们需要先用95%乙醇浸泡，然后再用干净的手帕擦干，用锡纸包裹后，180 °C烘6 h。如果载玻片本身很干净无浮尘，也可以直接180 °C烘6 h。但是如果载玻片不干净，会影响粘片和封片。
   烘好后的玻片要涂上0.1% poly-L-lysine溶液(Sigma或生工，RNase free)。抹片方法：在超净台上，先铺一张干净的A4纸张，将载玻片正面朝上排成两列摆在纸上(磨砂面方便用铅笔写字，为正面)。在其中一列载玻片中央加20 μl poly-L-lysine，然后依次将滴有poly-L-lysine的和无poly-L-lysine的载玻片面对面涂抹均匀，注意不要有气泡，涂完后放置在干净的切片盒中。37 °C烘干，至少1 h。
   

   1.9

   切片
   切片前，依次用70%乙醇和DEPC·H₂O擦干净切片台面、切片机、展片台。切片厚度一般为8-10 μm (如果不能得到连续蜡带或蜡带中出现较多空洞，可在取材后将材料进一步剪小，并适当延长脱水、透明和浸蜡各步骤的处理时间，使蜡渗透充分)。展片时，先滴1 ml DEPC-H₂O在载玻片上，选取需要的切片(光面朝下)漂浮在DEPC-H₂O水滴上。小心将载玻片转移到40 °C左右的展片台上，待切片展开就用枪吸走DEPC-H₂O，再稍微在展片台放置，甩掉剩余的DEPC-H₂O，放入切片盒中。注意展片台温度不能过高，否则会产生气泡，破坏切片。
   注：展片时间也不能过久，超过5 min会导致RNA降解。切好的切片37-42 °C烘干1-2天，就可做杂交。切好的切片不能放置太久，最好其他步骤都准备好了再切片。
2. 探针的设计与合成
   2.1

   探针的设计原则：

   1)

   探针特异性要好，与其他基因的匹配长度不要超过50 bp；
   

   2)

   用于杂交的探针长度为150-200 bp，超过此长度的探针需要水解(见后面)，用于转录的模板不要超过1.5 Kb；
   

   3)

   探针的GC含量最好在40-60%，没有连续重复的碱基。
   2.2

   探针模板的克隆与线性化：
   将选取的cDNA片段扩增，克隆在含有T7、SP6启动子的载体上，如p-GEM-T或p-GEM-T Easy载体上。线性化需要用5’突出末端的内切酶，如SalⅠ和NcoⅠ，酶切的质粒量为20-50 μg，酶切体系200 μl，酶切时间2 h至过夜。纯化前，需取1 μl酶切产物跑胶检测，确定酶切完全。
   酶切完毕，需要纯化，以确保模板没有RNase等杂质。纯化在进口离心管中进行，试剂用RNA专用的。纯化步骤如下：

   1)

   将酶切体系补水至500 μl，向其加入250 μl Tris饱和的苯酚和250 μl CHCl₃，震荡5 min，12,000 rpm离心5 min。
   

   2)

   吸上层水相上清，转移至新管中，加500 μl CHCl₃，震荡5 min，12,000rpm离心5 min.
   

   3)

   吸上清，转移至新管中，加1/10体积的3 M NaAc (pH 5.2，DEPC-H₂O配)，2倍体积的无水乙醇，-20 °C冷冻3 h至过夜。
   

   4)

   4 °C冷冻离心，12,000 rpm离心15 min。
   

   5)

   70%乙醇浸洗沉淀，去上清，吹干。
   

   6)

   加20 μl DEPC-H₂O溶解沉淀，测浓度。
   2.3

   探针的转录：
   探针转录用Roche公司的DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)，货号1 175 025。转录所用到的试剂均用DEPC-H₂O配制，转录的步骤如下：

   1)

   转录体系：
   线性化的模板 1 μg
   10x Transcription Buffer 2 μl
   10x DIG RNA Labeling Mix 2 μl
   Ribonuclease Inhibitor (TaKaRa) 1 μl
   T7/SP6 RNA Polymerase 2 μl
   补充DEPC·H₂O至总体积20 μl，37 °C转录2-2.5 h
   

   2)

   DNase I (invitrogen) 2.5 μl 37 °C处理15 min，去掉DNA模板。
   

   3)

   加1 μl 0.5 M EDTA (pH 8.0)终止反应。
   

   4)

   加2.5 μl 4 M LiCl和75 μl无水乙醇，-20 °C冷冻3 h至过夜。
   

   5)

   0 °C冷冻离心，12,000 rpm离心20 min。
   

   6)

   去掉上清，加80%乙醇150 μl浸洗，0 °C冷冻离心，12,000 rpm 离心20min。
   

   7)

   小心吸走上清，超净台上吹干，加20-40 μl DEPC·H₂O溶解。测浓度，跑胶检测，-70 °C保存。如果转录的探针长度合适，就此完成；如果长度过长，探针不易进入细胞，需要碱水解，继续往下进行。

   1. 碱水解的时间计算公式如下：
      T=(L₀-L_f)/(K×L₀×L_f)
      L₀：探针初始长度(Kb)；L_f：探针终长度(Kb)；K：0.11 Kb/min.
      水解溶液为20 μl 100 mM NaHCO₃和30 μl 100 mM Na₂CO₃，加在总体积为100 μl。水解温度为60 °C，水解时间按上述公式。
      
   2. 水解后加入5 μl 10%冰乙酸，10 μl 3 M NaAc，2倍体积的无水乙醇，-20 °C冷冻3 h至过夜。
      
   3. 0 °C冷冻离心，12,000 rpm 离心20 min。
      
   4. 去掉上清，加80%乙醇150 μl浸洗，0 °C冷冻离心，12,000 rpm 离心20 min。
      
   5. 重复步骤d。
      
   6. 小心吸走上清，超净台吹干。溶于20 μl DEPC·H₂O，测浓度，跑胶检测。保存于-70 °C。
   2.4

   探针方向的确定：
   用于原位杂交检测的探针是与体内mRNA互补的RNA，称为反义RNA；用于阴性对照的探针是与体内mRNA方向相同的，称为正义RNA。连接入p-GEM-T或p-GEM-T Easy载体的cDNA的方向决定了探针的方向。
   如果cDNA在载体中的连接方向如图1所示时，用NcoⅠ酶切、SP6转录酶转录的探针是反义RNA，用SalⅠ酶切、T7转录酶转录的探针是正义RNA。如果cDNA连接的方向相反，则探针方向也反过来。
   注：这一点非常重要，建议重点强调，这个图示很简明清晰，很好。
   
   
   图1. cDNA在载体中的连接方向
   
3. 杂交
   3.1

   试剂配制 (见溶液配方)
   
   3.2

   杂交前的准备：脱蜡缸、镊子、剪刀等要180 °C烘6 h，切片要37-42 °C烘1-2天。10x Blocking solution (3)从-20 °C冰箱拿出解冻 (DIG Wash and Block Buffer Set，Roche)。
   
   

   杂交第一天 (步骤3.3-3.7)

   3.3

   脱蜡和复水，通风橱中进行：

   
   在脱蜡的同时配制并预热Proteinase K buffer (见溶液配方)，37 °C温箱中预热。

   3.4

   Proteinase K处理
   Proteinase K稀释到1 μg/ml, 37 °C处理40 min。PBS洗一次，2 mg/ml Glycine浸泡2 min，再次用PBS洗一次。
   
   3.5

   脱水，用刚才(3.3脱蜡和复水)的溶液：
   
   超净台上吹干，约30-50 min。
   
   3.6

   预杂交：
   先配制10x Hybridization salts，可4 °C保存 (见溶液配方)。
   吸50%硫酸葡聚糖需要剪去枪头，配制过程尽量不要产生气泡，有气泡需要离心消泡。预杂交液可以-20 °C保存。
   预杂交时，取150 μl预杂交液滴加在吹干的载玻片上，并用大小合适的干净parafilm覆盖，不能产生气泡。将载玻片转移至离心管盒子中，盒中加DEPC·H₂O，盖严以保湿。42°C预杂交1-3 h。
   
   3.7

   杂交：
   在预杂交液中加入探针，使其浓度为400-1000 ng/ml。取下载玻片上的parafilm，并在面巾纸上吸干，将稀释好的探针滴加150 μl于载玻片上，用parafilm覆盖，放入湿盒中。42°C杂交16-20 h。

   
   

   杂交第二天 (步骤3.8-3.14)，不再需要用DEPC-H₂O配制试剂

   3.8

   2x SSPE洗三次 (见溶液配方)
   第一次揭开parafilm，将玻片浸入2x SSPE中。第二次、第三次，42 °C 15min。
   
   3.9

   0.2x SSPE洗两次 (见溶液配方)
   57°C杂交炉中，最小转速，30 min，两次。
   
   3.10

   1x Blocking buffer洗，室温摇床，最小转速，30 min。(见溶液配方)
   
   3.11

   免疫反应：
   配制BSA washing buffer (200 ml，现配现用，方法见溶液配方)。
   先将Anti-Digoxigenin-AP离心12000 rpm 5min，取上清，稀释在BSA washing buffer(见溶液配方)中，稀释比为1:2500-1:5000，室温杂交2 hrs，最小转速摇晃。
   
   3.12

   洗抗体：
   BSA washing buffer洗三次，每次15min，最小转速摇晃。
   在此期间配制TNM-50 buffer(120ml)(见溶液配方)
   
   3.13

   TNM-50 buffer洗三次，每次5 min。
   
   3.14

   显色反应：
   避光配制显色液，30 ml TNM-50 buffer中加入0.3-0.8 ml NBT/BCIP stock solution (Roche, Cat. No. 1 681 451)，依照具体显色情况，避光显色过夜。

   
   

   杂交第三天 (步骤3.15-3.18)

   3.15

   待到实验组明显显色而阴性对照没有显色时，将载玻片转移至双蒸水中，洗三次，每次2min。
   
   3.16

   脱水，用第一天的溶液：
   
   因为显出的颜色溶于乙醇，所以脱水的过程要比较快，特别是当显出的颜色比较浅的时候，每一级不要超过10 sec。
   
   3.17

   封片，37 °C烘干。
   
   3.18

   拍照观察。
   

溶液配方

1. 50%FAA固定液 (100 ml)
   

   无水乙醇	50 ml
   37%甲醛溶液	10 ml
   冰乙酸	5 ml

   加DEPC-H₂O定容至100 ml
   
2. 70% FAA固定液 (100 ml)
   

   无水乙醇	70 ml
   37%甲醛溶液	10 ml
   冰乙酸	5 ml

   加DEPC·H₂O定容至100 ml
   注：50%FAA适用于幼穗、SAM等幼嫩组织的固定，70%FAA适用于根、茎秆、叶片等成熟组织的固定。
   
3. 1 M Tris-HCl (pH 7.5) (500 ml)
   

   Tris base	60.55 g
   浓盐酸约	32 ml

   加浓盐酸调pH至7.5
   定容至500 ml
   
4. 1 M Tris-HCl (pH 9.5) (300 ml)
   

   Tris base	36.33 g
   浓盐酸	1 ml

   加浓盐酸调pH至9.5
   定容至300 ml
   
5. 0.5 M EDTA-2Na, pH 8.0 (500 ml)
   

   EDTA-2Na	93.06 g
   NaOH约	10 g

   完全溶解后，调pH至8.0
   定容于500 ml
   
6. 1 M MgCl₂ (100 ml)
   

   MgCl2·6H2O

   20.331 g

   定容至100 ml
   
7. 5 M NaCl (500 ml)
   

   NaCl

   146.1 g

   定容至500 ml
   
8. 20x SSPE, pH 7.4 (1 L)
   

   NaCl	175.3 g
   NaH2PO4	24 g
   0.5 M EDTA (pH 8.0)	40 ml

   定容至1 L
   
9. 10x PBS，pH 7.4 (500 ml)
   

   NaCl	38 g
   NaH2PO4	1.8 g
   Na2HPO4	4.95 g

   定容至500 ml
   
10. 50%硫酸葡聚糖(Detran sulfate)
    

    Detran sulfate	5 g
    定容至	10 ml

    分装至1.5 ml离心管中，保存于-20 °C
    注：50%硫酸葡聚糖比较粘稠，配好之后直接按照需要的量(1 ml)分装到10 ml的离心管中，保存在4度，用的时候可直接往离心管中加其他成分。
    
11. 10 mg/ml yeast t-RNA
    

    25 mg

    yeast t-RNA (invitrogen)

    溶于2.5 ml DEPC-H₂O中
    注：
    1)

    试剂都要用灭菌的DEPC-H₂O配，配试剂用到的量筒需要180 °C烘6 h。
    
    2)

    4-10在配好后需要灭菌。用时都要在超净台上打开，以免长菌。
12. Proteinase K buffer (100 ml)
    

    1 M Tris-HCl (pH 7.5)	10 ml
    0.5 M EDTA-2Na (pH 8.0)	10 ml
    DEPC-H2O	80 ml

13. 10x Hybridization salts (10 ml)
    

    1 M Tris-HCl (pH 7.5)	1 ml
    0.5 M EDTA-2Na (pH 8.0)	200 μl
    5 M NaCl	6 ml
    DEPC-H2O	2.8 ml

14. Prehybridization solution (10 ml)
    

    DEPC-H2O	1.85 ml
    去离子甲酰胺	5 ml
    10x Hybridization salts	1 ml
    50%硫酸葡聚糖	1 ml
    10x Blocking solution (3)	1 ml
    10 mg/ml yeast t-RNA	150 μl

15. 1x Blocking buffer (40 ml，现配现用)
    

    10x Blocking buffer (3)	4 ml
    10x Blocking buffer (2)	3.6 ml
    加ddH2O至	40 ml

16. BSA washing buffer (200 ml，现配现用)
    

    BSA	2 g
    Triton X-100	600 μl
    1 M Tris-HCl (pH 7.5)	20 ml
    5 M NaCl	6 ml
    加ddH2O至	200 ml

17. TNM-50 buffer (120 ml)
    

    1 M Tris-HCl (pH 9.5)	12 ml
    5 M NaCl	2.4 ml
    1 M MgCl2	6 ml
    加ddH2O至	120 ml