材料和试剂

5 或 15 mL 锥形管
40 µm 细胞过滤器（Corning，目录号：431750）
Slide-A-Lyzer TM G2 透析盒，10K MWCO，3 mL（Thermo Fisher，目录号：87730）
Pierce TM谷胱甘肽磁性琼脂糖珠（Thermo Fisher，目录号：78601）。保持在 4 °C
One Shot BL21（DE3）化学感受态大肠杆菌（Thermo Fisher，目录号：C600003）。将未使用的大肠杆菌颗粒保持在 -80 °C
L-谷胱甘肽还原（Millipore Sigma，目录号：G4251-300MG）
HyperPAGE II 预染色蛋白标记物（Bioline，目录号：BIO-33066）。将等分试样保持在 -20 °C
Dynabeads TM蛋白 G（Invitrogen，目录号：10003D）。保持在 4 °C
抗 GFP 抗体（Sigma-Aldrich，目录号：11814460001）。重悬后保持在-20°C
UAS-EGFP.KASH-Msp300 苍蝇（布卢明顿果蝇股票中心，BDSC#92580）
Digitonin 5％（Thermo Fisher，目录号：BN2006）
UltraPure TM二硫苏糖醇 (DTT) 0.1 M 溶液（Thermo Scientific，目录号 707265ML）
UltraPure TM乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）（Thermo Fisher，目录号：15576028）
UltraPure TM 1 M Tris-HCl，pH 8.0（Invitrogen，目录号 15568025）
EGTA，分子生物学级（Millipore，目录号：324626）
cOmplete TM ，迷你，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Roche，目录号：04693159001）
Corning ® 100 mL HEPES，液体 1 M 溶液（238.3 mg/mL）（Corning，目录号：25-060-CI）
IGEPAL ® CA-630（Supelco，目录号：56741-50ML-F）
TWEEN ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
考马斯亮蓝 R-250 染料（Thermo Scientific，目录号：20278）
冰醋酸，ReagentPlus ® （Sigma-Aldrich，目录号 A6283）
甲醇，ACS 试剂（Sigma-Aldrich，目录号 179337）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S022-1G）
RNase A（Thermo Fisher，目录号：12091021）
线性丙烯酰胺（Thermo Fisher，目录号：AM9520）
RNase H（New England BioLabs，目录号 M0297S）。保持在-20°C
ChIP DNA Clean & Concentrator（Zymo，目录号 D5205）
Qubit TM 1 × dsDNA 高灵敏度（HS）（Thermo Fisher，目录号：Q33230）
注意：我们建议使用高灵敏度检测，因为获得的 DNA 输入量低且难以使用传统试剂进行量化。
Ovation ®超低 V2 DNA-Seq 文库制备试剂盒（Tecan，目录号：0344NB-08）
GST-洗涤/平衡缓冲液（见配方）
GST 洗脱缓冲液（参见配方）
考马斯定影液（见配方）
考马斯染色溶液（见配方）
考马斯脱色溶液（见配方）
均质化/洗涤缓冲液（参见配方）
稀释缓冲液（见配方）
珠子洗涤缓冲液（见配方）
PBST (1 × , pH 7.4) (见食谱)
挖洗缓冲液（见配方）
低盐冲洗缓冲液（见配方）
激活缓冲液（见配方）
EGTA-STOP 缓冲器 (1 × )（见配方）

设备

必能信扩音器
安捷伦 TapeStation 4200
WHEATON ® Dounce 组织研磨机，1 mL
37°C培养箱（如Thomas Scientific SCO2W台式水套CO 2培养箱，目录号：1229P58）
冷 (4 °C) 离心机（例如 Eppendorf TM ，型号： Centrifuge 5424 R）
冷（4°C）培养箱（如Fisherbrand TM mini低温冷藏培养箱，目录号： 15-015-2632）
管旋转器旋转器（例如 Thermo Scientific TM管旋转器旋转器，目录号：88881001）
磁架（如 Millipore PureProteome TM磁架，目录号：LSKMAGS08）
凝胶电泳室（如 Bio-Rad Mini-PROTEAN ® tetra 垂直电泳槽，目录号：1658025FC）

软件

测序读数的基因组比对：Bowtie2 (Langmead and Salzberg, 2012)
BAM 文件处理：Samtools (Li et al., 2009)
Bigwig 生成/处理：Deeptools (Ramírez et al., 2014)
综合基因组浏览器（Thorvaldsdóttir 等人，2013 年）

程序

大肠杆菌转化和蛋白质纯化
对于该协议，我们执行了大肠杆菌转化和蛋白质过表达诱导，如原始 MapR 方法论文（Yan 和 Sarma，2020）中所述。我们还在Jauregui-Lozano 等人中描述了这些步骤。（2022 年）。
使用 10 ng 质粒并按照 New England Biolabs 的制造商说明转化 BL21 DE3 细胞。
在 37°C 下将 LB 培养基板中的板转化细胞过夜。
在 37°C 和 225 rpm 的条件下，选择单个菌落并在补充有羧苄青霉素 (1 μ g/mL) 的液体 LB 培养基中生长。
第二天，将 4.5 mL 的液体培养物添加到 495 mL 的液体 LB 培养基中，辅以羧苄青霉素，并在 37°C 和 225 rpm 下孵育 2-4 小时。孵育 2 小时后，检查液体培养的等分试样的光密度，直到用分光光度计测量达到 0.6。
通过将 IPTG 添加到 0.5 mM 的最终浓度来诱导蛋白质表达。
在 37°C 和 225 rpm 下孵育含 IPTG 的液体培养 3 小时。
准备新鲜的 GST 洗涤/平衡缓冲液和 GST 洗脱缓冲液。
在冷离心机中以 8,000 × g离心细菌裂解物 10 分钟。
用 cOmplete TM蛋白酶抑制剂去除上清液并在 5 mL 的冷 PBS 缓冲液中重新悬浮细菌颗粒。
使用振幅为 20% 的Branson 声音放大器和 5 个 15 秒开到 45 秒关的周期进行声波处理。确保在超声处理期间含有细菌裂解物的锥形管在冰上。
× g下离心 20 分钟。
将可溶性裂解物转移到新的 5 或 15 mL 锥形管中。
平衡 1 mL 的 Pierce TM谷胱甘肽磁性琼脂糖珠 GST。
涡旋 10 s，放置在磁铁上，去除上清液，并添加 1 mL 的洗涤/平衡缓冲液。
将 DTT 和 EDTA 添加到可溶性裂解物中（每个最终 1 mM）。
从珠子中去除上清液并将珠子转移到可溶性裂解物中。
在 4 °C 下持续旋转孵育 1-2小时。
使用磁铁，去除上清液并加入 1 mL 的洗涤缓冲液。将 20 – 50 μ L 的上清液保存为“流穿”样品，以供以后运行 SDS 页时使用。
在 4°C 下孵育并不断旋转。
使用磁铁去除洗涤缓冲液并再重复洗涤步骤两次。
去除洗涤缓冲液并添加 250 μL 的 GST 洗脱缓冲液。
在 4°C 下持续旋转孵育 10 分钟。
收集洗脱液 #1 [e#1] 并再重复洗脱步骤两次。
向每个 250 μL 洗脱液中加入 41 μL先前重悬于 GST 洗脱缓冲液中的 7 × cOmplete TM蛋白酶抑制剂。
运行带有流通和洗脱物的 SDS 页以评估纯化效率（图 1）。

图 1. 考马斯染色 SDS 页评估纯化效率。
使用 SDS 页评估 GST 蛋白质纯化的效率，然后用考马斯蓝染色。对于流穿 (FT)，上样 20 μ g 蛋白质；对于洗脱部分，上样2 μ g 蛋白质。 GST-ΔRH-MNase 的大小约为 60 kDa，而 GST-MNase 的大小约为 40 kDa。

运行 SDS-page 后，将凝胶转移到考马斯固定液中 30 分钟，然后放入摇杆中。
将固定凝胶转移到考马斯染色溶液中 1 小时，然后放入摇杆中。
将染色的凝胶转移到考马斯脱色溶液中 20 分钟，然后放入摇杆中。
更换考马斯脱色溶液，并置于摇杆中。
重复步骤 28 和 29 两次（总共 1 小时 20 分钟脱色）。 GST-MNase 的分子量接近 40 kDa，而 GST-ΔRH-MNase 的分子量接近 60 kDa。
透析蛋白质，加入甘油保存在-20°C，并根据原始MapR方法（Yan和Sarma，2020）定量蛋白质。

样品制备
果蝇中纯化组织特异性细胞核，请按如下方式进行细胞核免疫富集：对于本协议，我们从 UAS-EGFP.KASH-Msp300 果蝇中进行组织特异性细胞核免疫沉淀（可在布卢明顿果蝇库存中心获得，参见方法）。这些果蝇在与 Gal4 飞线交叉时，会在特定组织中表达锚定在外核膜上的 GFP。然后，可以使用磁珠和 GFP 抗体来纯化这些细胞核。我们还描述了这些步骤(Jauregui-Lozano et al., 2021) ，并且这种方法与不同的染色质分析技术兼容。
准备新鲜的珠子洗涤缓冲液、均质/洗涤缓冲液和稀释缓冲液并保持在冰上。
在室温 (RT) 下以恒定旋转在 1 mL 的珠子洗涤缓冲液中孵育 40 μL 的Dynabeads TM 10 分钟。
将管子转移到磁性架子上。将机架倒置数次以确保所有珠子都与磁铁结合。用移液器去除上清液。
µg 抗 GFP 抗体在 1 mL 珠子洗涤缓冲液中重悬珠子。
在 RT 中孵育珠子 30 分钟，不断旋转以与 GFP 抗体结合。
使用磁铁，去除上清液。
用 1 mL 珠子洗涤缓冲液在 RT 中以恒定旋转洗涤珠子 5 分钟。
使用磁铁，去除上清液。
在 0.1% NP-40 均质/洗涤缓冲液中重悬珠子。将三份稀释缓冲液与一份均质化/洗涤缓冲液混合，最终浓度为 0.1% NP-40。
用 1 mL 的均质/洗涤缓冲液加载 Dounce 均质机。将均质器放在冰上。
将果蝇样品转移到均质器中。
400 个飞头（在液氮中快速冷冻并储存在 -80°C）可与 1 mL 的均质化/洗涤缓冲液一起使用，以从成人头部的神经元组织中分离细胞核。
也可以使用新鲜样品，例如幼虫组织或整个胚胎。
用 5 次“松散”的杵敲击研磨样品。
在冰上孵育样品 5 分钟。
用另外 5 次“松”杵敲击，然后再用 10 次“紧”杵敲击研磨样品。
使用 40 μm 细胞过滤器过滤飞匀浆。
将 3 mL 的稀释缓冲液添加到过滤的 1 mL 匀浆中，最终浓度为 0.1% NP-40。
将 4 mL 的匀浆均匀地分成四个 1.5 mL 管（每管 1 mL）。
加入 50 μL 的珠子/抗体溶液。
在 RT 中用珠子/抗体溶液孵育飞匀浆 30 分钟，并不断旋转以将细胞核与抗 GFP 珠子耦合。
使用磁铁，去除上清液。
将所有四个管中的珠结合核结合到 1 mL 的 0.1% NP-40 均质/洗涤缓冲液中。
在 4°C 下持续旋转孵育 5 分钟。
使用磁铁，去除上清液。
在 1 mL 的 0.1% NP-40 均质/洗涤缓冲液中重新悬浮珠结合核，并转移到新的 1.5 mL 管中。
在 4°C 下持续旋转孵育 5 分钟。
使用磁铁，去除上清液。
在 4°C 下以恒定旋转在 1 mL 的 0.1% NP-40 均质/洗涤缓冲液中清洗珠结合核 5 分钟。
注意：如前所述(Jauregui-Lozano et al., 2021) ，此方法将产生适用于 MapR 的珠结合核。否则，如原始 MapR 方法（Yan 和 Sarma，2020）中所述，使用涂有伴刀豆球蛋白 A 的珠子纯化细胞核。

修改后的 MapR
用 1 mL 的挖掘洗涤缓冲液清洗珠结合核。
对于每个洗涤步骤，在 4°C 下孵育珠结合核 5 分钟，并持续旋转。
使用磁铁，去除 dig-wash 缓冲液，然后再重复两次洗涤步骤。
在 150 μL 的 dig-wash 缓冲液中重新悬浮珠结合核。
添加 GST-ΔRH-MNase 或 GST-MNase 至最终浓度为 1 μM。
要根据蛋白质浓度计算蛋白质摩尔浓度，请使用以下公式：

μM=(μg/mL)/(MW(kDa))

在哪里，
μg/mL 是使用传统蛋白质定量试剂获得的蛋白质浓度，例如 Bradford Assay 或 Qubit TM蛋白质测定试剂盒 (Thermo Fisher)。
MW (kDa) 是蛋白质的分子量。 GST-MNase 的 MW 为 44 kDa，GST-dRH-MNase 的 MW 为 61.5 kDa。
Bioline 网站有一个在线计算器来执行此计算： https ://www.bioline.com/media/calculator/01_04.html 。
在 4°C 下孵育，持续旋转 1 小时。
用 500 μL 的 dig-wash 缓冲液清洗珠结合核 3 次。
用低盐冲洗缓冲液清洗珠结合核一次。
在 200 μL 冰冷的含钙活化缓冲液中重新悬浮珠结合核，并在湿冰上放置 60 秒。
使用磁铁，去除上清液并立即加入 150 μL EGTA-STOP 缓冲液。
在 37°C 下孵育 30 分钟。
使用磁铁，将上清液转移到新试管中，并使用 ChIP DNA clean & concentrator 从上清液中提取 DNA。上清液含有释放的富含 R 环的 DNA；确保从上清液中纯化 DNA。
使用 Nanodrop 或 Qubit TM DNA 试剂定量 DNA。
® Ultralow V2 DNA-Seq 文库制备试剂盒，使用 100 pg – 10 ng 的纯化 DNA 制作可测序的 MapR 文库。

数据分析

笔记：
在此示例中，我们使用黑腹果蝇参考基因组“BDGP Release 6 + ISO1 MT/dm6”或 dm6，可在https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/dm6/bigZips/获得。
在命令行中运行的代码以 $ 开头。

比对到参考基因组
使用 Bowtie2 索引参考基因组
$ bowtie2-build --threads [# of threads/cores] [参考基因组 fasta 文件] [用于命名索引文件的文件名]
下面是使用 64 个线程运行 bowtie2-build 命令并使用名为“dm6.fa”的参考基因组 fasta 文件后前 20 行的屏幕截图。 dm6 将用作索引文件的文件名。

将原始/干净的测序读数与参考基因组对齐（通过管道直接生成 BAM 文件而不是 SAM）。
$ bowtie2 -p [# of threads/cores] --sensitive -x [在步骤 1 中指定的索引] -1 CleanReads_1.fq -2 CleanReads_2.fq | samtools view -@ [# of threads/cores] -bSo Output.bam
按基因组坐标对 BAM 文件进行排序（使用 deepTools 生成 bigwig 文件需要此步骤）
$ samtools sort -@ [# of threads/cores] -o Output_sorted.bam Output.bam
用于数据可视化的 Bigwig 生成
-使用深度工具
$ bamCoverage -b BAMfile.bam -o output_file.bw -bs [bin size] -p [# of threads/cores] --normalizeUsing CPM

基因组浏览器检查

图 2. 使用或不使用 RNAse H1 预处理的 MapR 数据的基因组浏览器检查。
数据在基因组浏览器（例如 Integrative Genomics Browser，或 IGV）中使用每百万计数 (CPM) 标准化的大人物文件进行可视化。为了比较富集，两条轨道都被缩放到相同的值。

笔记

传统的 MapR 包含 R 环富集的控制，其中一部分珠结合核与 GST-MNase 一起孵育。在这个实验条件下，研究人员可以控制随机 MNase 与染色质或背景的结合。出乎意料的是，我们无法让 MNase 控件工作。我们在进行实验时没有获得可纯化的 DNA。对于纯化 DNA 的定量，我们使用了 High Sensitivity QubitTM，它可以定量少量的 DNA（皮克）。因此，我们进行了额外的控制，在执行 MapR 之前，我们用催化活性 RNAse H1 处理了一小部分珠结合核 3 小时。
用于数据可视化的分析大人物文件从 Gene Expression Omnibus (GEO) 下载，登录代码 GSE174488。它们对应于来自黑腹果蝇感光神经元的 MapR，如Jauregui-Lozano 等人最初所述。（2022 年）。

食谱

GST-洗涤/平衡缓冲液
试剂最终浓度数量
Tris (1 M pH 7.5)125 毫米1,250 µL
氯化钠 (5 M)150 毫米300 µL
数字地面电视 (100 毫米)1毫米100 µL
EDTA (500 毫米)1毫米20 µL
H 2 O
全部的不适用毫升
10 毫升

GST 洗脱缓冲液
试剂最终浓度数量
谷胱甘肽（还原）（1 M）50毫米500 µL
GST-洗涤/平衡缓冲液
全部的不适用9.5 毫升
10 毫升

考马斯固色液
试剂最终浓度数量
甲醇50%50 毫升
冰醋酸
H 2 O
全部的10%10 毫升
40 毫升
100 毫升

考马斯染色溶液
试剂最终浓度数量
考马斯亮蓝0.10.1克
甲醇
冰醋酸
H 2 O
全部的50%
10%50 毫升
10 毫升
40 毫升
100 毫升
或者，您可以制作 10% 考马斯蓝储备溶液（1 g 考马斯试剂 + 10 mL H 2 O），然后将 1 mL 的 10% 储备溶液添加到考马斯染色溶液中。

考马斯脱色液
试剂最终浓度数量
甲醇40%40 毫升
冰醋酸
H 2 O
全部的10%10 毫升
50 毫升
100 毫升

均质化/洗涤缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1M, pH 7.5)40毫米400 µL
氯化钾 (1M)120 毫米1.2 毫升
NP-40 (10%)0.4%400 µL
H 2 O不适用8 毫升
全部的10 毫升

稀释缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1 M, pH 7.5)40毫米400 µL
氯化钾 (1 M)120 毫米1.2 毫升
H 2 O不适用8.4 毫升
全部的10 毫升

珠洗缓冲液
试剂最终浓度数量
氯化镁22.5 毫米25 µL
PBST (1 × )不适用9.975 毫升
全部的10 毫升

PBST (1 × , pH 7.4)
试剂最终浓度数量
PBS (10 × )1 ×5 毫升
吐温0.1%50 µL
H 2 O不适用44.950 毫升
全部的50 毫升

挖洗缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1 M, pH 7.5)20毫米1毫升
亚精胺（6.4 M，pH 7.0）0.5 毫米3.9 µL
氯化钠 (5 M)150 毫米1.5 毫升
H 2 O
全部的不适用47.5 毫升
50 毫升

低盐冲洗缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1 M, pH 7.5)20毫米200 µL
亚精胺 (6.4 M)0.5 毫米0.8 µL
洋地黄皂苷 (5%)0.05%100 µL
H 2 O不适用9.62 毫升
全部的不适用10 毫升

激活缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1 M, pH 7.5)3.5 毫米14 µL
氯化钙 (100 毫米)10毫米400 µL
洋地黄皂苷 (5%)0.05%40 µL
H 2 O不适用3.46 毫升
全部的不适用4 毫升

EGTA-STOP 缓冲器 (1 × )
试剂最终浓度数量
氯化钠 (5M)170 毫米34 µL
EGTA (100 毫米)20毫米200 µL
洋地黄皂苷 (5%)0.05%10 µL
RN酶 A (10 µg/µL)0.05%5 µL
线性丙烯酰胺 (5 µg/µL)0.025%5 µL
H 2 O不适用746 µL
全部的不适用1毫升

致谢

这项研究得到了美国国立卫生研究院 - 国家眼科研究所授予 R21 EY031024 的支持。该协议描述了 Jauregui-Lozano 等人的研究论文 (DOI: 10.1111/acel.13554) 中使用的方法。（2022 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。

参考

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García-Muse , T. 和 Aguilera, A. (2019)。 R 循环：从生理到病理角色。单元格179（3）：604-618。
Jauregui-Lozano, J.、Bakhle, K. 和 Weake, VM (2021)。使用 GFP 标记的细胞核对黑腹果蝇进行体内组织特异性染色质分析。遗传学218（3）。
Jauregui-Lozano, J.、Escobedo, S.、Easton, A.、Lanman, NA、Weake, VM 和 Hall, H. (2022)。在衰老过程中维持基因表达和神经元功能需要适当控制 R 环稳态。老化细胞21(2)：e13554。
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材料和试剂

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抗 GFP 抗体（Sigma-Aldrich，目录号：11814460001）。重悬后保持在-20°C
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UltraPure TM乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）（Thermo Fisher，目录号：15576028）
UltraPure TM 1 M Tris-HCl，pH 8.0（Invitrogen，目录号 15568025）
EGTA，分子生物学级（Millipore，目录号：324626）
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Corning ® 100 mL HEPES，液体 1 M 溶液（238.3 mg/mL）（Corning，目录号：25-060-CI）
IGEPAL ® CA-630（Supelco，目录号：56741-50ML-F）
TWEEN ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
考马斯亮蓝 R-250 染料（Thermo Scientific，目录号：20278）
冰醋酸，ReagentPlus ® （Sigma-Aldrich，目录号 A6283）
甲醇，ACS 试剂（Sigma-Aldrich，目录号 179337）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S022-1G）
RNase A（Thermo Fisher，目录号：12091021）
线性丙烯酰胺（Thermo Fisher，目录号：AM9520）
RNase H（New England BioLabs，目录号 M0297S）。保持在-20°C
ChIP DNA Clean & Concentrator（Zymo，目录号 D5205）
Qubit TM 1 × dsDNA 高灵敏度（HS）（Thermo Fisher，目录号：Q33230）
注意：我们建议使用高灵敏度检测，因为获得的 DNA 输入量低且难以使用传统试剂进行量化。
Ovation ®超低 V2 DNA-Seq 文库制备试剂盒（Tecan，目录号：0344NB-08）
GST-洗涤/平衡缓冲液（见配方）
GST 洗脱缓冲液（参见配方）
考马斯定影液（见配方）
考马斯染色溶液（见配方）
考马斯脱色溶液（见配方）
均质化/洗涤缓冲液（参见配方）
稀释缓冲液（见配方）
珠子洗涤缓冲液（见配方）
PBST (1 × , pH 7.4) (见食谱)
挖洗缓冲液（见配方）
低盐冲洗缓冲液（见配方）
激活缓冲液（见配方）
EGTA-STOP 缓冲器 (1 × )（见配方）

设备

必能信扩音器
安捷伦 TapeStation 4200
WHEATON ® Dounce 组织研磨机，1 mL
37°C培养箱（如Thomas Scientific SCO2W台式水套CO 2培养箱，目录号：1229P58）
冷 (4 °C) 离心机（例如 Eppendorf TM ，型号： Centrifuge 5424 R）
冷（4°C）培养箱（如Fisherbrand TM mini低温冷藏培养箱，目录号： 15-015-2632）
管旋转器旋转器（例如 Thermo Scientific TM管旋转器旋转器，目录号：88881001）
磁架（如 Millipore PureProteome TM磁架，目录号：LSKMAGS08）
凝胶电泳室（如 Bio-Rad Mini-PROTEAN ® tetra 垂直电泳槽，目录号：1658025FC）

软件

测序读数的基因组比对：Bowtie2 (Langmead and Salzberg, 2012)
BAM 文件处理：Samtools (Li et al., 2009)
Bigwig 生成/处理：Deeptools (Ramírez et al., 2014)
综合基因组浏览器（Thorvaldsdóttir 等人，2013 年）

程序

大肠杆菌转化和蛋白质纯化
对于该协议，我们执行了大肠杆菌转化和蛋白质过表达诱导，如原始 MapR 方法论文（Yan 和 Sarma，2020）中所述。我们还在Jauregui-Lozano 等人中描述了这些步骤。（2022 年）。
使用 10 ng 质粒并按照 New England Biolabs 的制造商说明转化 BL21 DE3 细胞。
在 37°C 下将 LB 培养基板中的板转化细胞过夜。
在 37°C 和 225 rpm 的条件下，选择单个菌落并在补充有羧苄青霉素 (1 μ g/mL) 的液体 LB 培养基中生长。
第二天，将 4.5 mL 的液体培养物添加到 495 mL 的液体 LB 培养基中，辅以羧苄青霉素，并在 37°C 和 225 rpm 下孵育 2-4 小时。孵育 2 小时后，检查液体培养的等分试样的光密度，直到用分光光度计测量达到 0.6。
通过将 IPTG 添加到 0.5 mM 的最终浓度来诱导蛋白质表达。
在 37°C 和 225 rpm 下孵育含 IPTG 的液体培养 3 小时。
准备新鲜的 GST 洗涤/平衡缓冲液和 GST 洗脱缓冲液。
在冷离心机中以 8,000 × g离心细菌裂解物 10 分钟。
用 cOmplete TM蛋白酶抑制剂去除上清液并在 5 mL 的冷 PBS 缓冲液中重新悬浮细菌颗粒。
使用振幅为 20% 的Branson 声音放大器和 5 个 15 秒开到 45 秒关的周期进行声波处理。确保在超声处理期间含有细菌裂解物的锥形管在冰上。
× g下离心 20 分钟。
将可溶性裂解物转移到新的 5 或 15 mL 锥形管中。
平衡 1 mL 的 Pierce TM谷胱甘肽磁性琼脂糖珠 GST。
涡旋 10 s，放置在磁铁上，去除上清液，并添加 1 mL 的洗涤/平衡缓冲液。
将 DTT 和 EDTA 添加到可溶性裂解物中（每个最终 1 mM）。
从珠子中去除上清液并将珠子转移到可溶性裂解物中。
在 4 °C 下持续旋转孵育 1-2小时。
使用磁铁，去除上清液并加入 1 mL 的洗涤缓冲液。将 20 – 50 μ L 的上清液保存为“流穿”样品，以供以后运行 SDS 页时使用。
在 4°C 下孵育并不断旋转。
使用磁铁去除洗涤缓冲液并再重复洗涤步骤两次。
去除洗涤缓冲液并添加 250 μL 的 GST 洗脱缓冲液。
在 4°C 下持续旋转孵育 10 分钟。
收集洗脱液 #1 [e#1] 并再重复洗脱步骤两次。
向每个 250 μL 洗脱液中加入 41 μL先前重悬于 GST 洗脱缓冲液中的 7 × cOmplete TM蛋白酶抑制剂。
运行带有流通和洗脱物的 SDS 页以评估纯化效率（图 1）。

图 1. 考马斯染色 SDS 页评估纯化效率。
使用 SDS 页评估 GST 蛋白质纯化的效率，然后用考马斯蓝染色。对于流穿 (FT)，上样 20 μ g 蛋白质；对于洗脱部分，上样2 μ g 蛋白质。 GST-ΔRH-MNase 的大小约为 60 kDa，而 GST-MNase 的大小约为 40 kDa。

运行 SDS-page 后，将凝胶转移到考马斯固定液中 30 分钟，然后放入摇杆中。
将固定凝胶转移到考马斯染色溶液中 1 小时，然后放入摇杆中。
将染色的凝胶转移到考马斯脱色溶液中 20 分钟，然后放入摇杆中。
更换考马斯脱色溶液，并置于摇杆中。
重复步骤 28 和 29 两次（总共 1 小时 20 分钟脱色）。 GST-MNase 的分子量接近 40 kDa，而 GST-ΔRH-MNase 的分子量接近 60 kDa。
透析蛋白质，加入甘油保存在-20°C，并根据原始MapR方法（Yan和Sarma，2020）定量蛋白质。

样品制备
果蝇中纯化组织特异性细胞核，请按如下方式进行细胞核免疫富集：对于本协议，我们从 UAS-EGFP.KASH-Msp300 果蝇中进行组织特异性细胞核免疫沉淀（可在布卢明顿果蝇库存中心获得，参见方法）。这些果蝇在与 Gal4 飞线交叉时，会在特定组织中表达锚定在外核膜上的 GFP。然后，可以使用磁珠和 GFP 抗体来纯化这些细胞核。我们还描述了这些步骤(Jauregui-Lozano et al., 2021) ，并且这种方法与不同的染色质分析技术兼容。
准备新鲜的珠子洗涤缓冲液、均质/洗涤缓冲液和稀释缓冲液并保持在冰上。
在室温 (RT) 下以恒定旋转在 1 mL 的珠子洗涤缓冲液中孵育 40 μL 的Dynabeads TM 10 分钟。
将管子转移到磁性架子上。将机架倒置数次以确保所有珠子都与磁铁结合。用移液器去除上清液。
µg 抗 GFP 抗体在 1 mL 珠子洗涤缓冲液中重悬珠子。
在 RT 中孵育珠子 30 分钟，不断旋转以与 GFP 抗体结合。
使用磁铁，去除上清液。
用 1 mL 珠子洗涤缓冲液在 RT 中以恒定旋转洗涤珠子 5 分钟。
使用磁铁，去除上清液。
在 0.1% NP-40 均质/洗涤缓冲液中重悬珠子。将三份稀释缓冲液与一份均质化/洗涤缓冲液混合，最终浓度为 0.1% NP-40。
用 1 mL 的均质/洗涤缓冲液加载 Dounce 均质机。将均质器放在冰上。
将果蝇样品转移到均质器中。
400 个飞头（在液氮中快速冷冻并储存在 -80°C）可与 1 mL 的均质化/洗涤缓冲液一起使用，以从成人头部的神经元组织中分离细胞核。
也可以使用新鲜样品，例如幼虫组织或整个胚胎。
用 5 次“松散”的杵敲击研磨样品。
在冰上孵育样品 5 分钟。
用另外 5 次“松”杵敲击，然后再用 10 次“紧”杵敲击研磨样品。
使用 40 μm 细胞过滤器过滤飞匀浆。
将 3 mL 的稀释缓冲液添加到过滤的 1 mL 匀浆中，最终浓度为 0.1% NP-40。
将 4 mL 的匀浆均匀地分成四个 1.5 mL 管（每管 1 mL）。
加入 50 μL 的珠子/抗体溶液。
在 RT 中用珠子/抗体溶液孵育飞匀浆 30 分钟，并不断旋转以将细胞核与抗 GFP 珠子耦合。
使用磁铁，去除上清液。
将所有四个管中的珠结合核结合到 1 mL 的 0.1% NP-40 均质/洗涤缓冲液中。
在 4°C 下持续旋转孵育 5 分钟。
使用磁铁，去除上清液。
在 1 mL 的 0.1% NP-40 均质/洗涤缓冲液中重新悬浮珠结合核，并转移到新的 1.5 mL 管中。
在 4°C 下持续旋转孵育 5 分钟。
使用磁铁，去除上清液。
在 4°C 下以恒定旋转在 1 mL 的 0.1% NP-40 均质/洗涤缓冲液中清洗珠结合核 5 分钟。
注意：如前所述(Jauregui-Lozano et al., 2021) ，此方法将产生适用于 MapR 的珠结合核。否则，如原始 MapR 方法（Yan 和 Sarma，2020）中所述，使用涂有伴刀豆球蛋白 A 的珠子纯化细胞核。

修改后的 MapR
用 1 mL 的挖掘洗涤缓冲液清洗珠结合核。
对于每个洗涤步骤，在 4°C 下孵育珠结合核 5 分钟，并持续旋转。
使用磁铁，去除 dig-wash 缓冲液，然后再重复两次洗涤步骤。
在 150 μL 的 dig-wash 缓冲液中重新悬浮珠结合核。
添加 GST-ΔRH-MNase 或 GST-MNase 至最终浓度为 1 μM。
要根据蛋白质浓度计算蛋白质摩尔浓度，请使用以下公式：

μM=(μg/mL)/(MW(kDa))

在哪里，
μg/mL 是使用传统蛋白质定量试剂获得的蛋白质浓度，例如 Bradford Assay 或 Qubit TM蛋白质测定试剂盒 (Thermo Fisher)。
MW (kDa) 是蛋白质的分子量。 GST-MNase 的 MW 为 44 kDa，GST-dRH-MNase 的 MW 为 61.5 kDa。
Bioline 网站有一个在线计算器来执行此计算： https ://www.bioline.com/media/calculator/01_04.html 。
在 4°C 下孵育，持续旋转 1 小时。
用 500 μL 的 dig-wash 缓冲液清洗珠结合核 3 次。
用低盐冲洗缓冲液清洗珠结合核一次。
在 200 μL 冰冷的含钙活化缓冲液中重新悬浮珠结合核，并在湿冰上放置 60 秒。
使用磁铁，去除上清液并立即加入 150 μL EGTA-STOP 缓冲液。
在 37°C 下孵育 30 分钟。
使用磁铁，将上清液转移到新试管中，并使用 ChIP DNA clean & concentrator 从上清液中提取 DNA。上清液含有释放的富含 R 环的 DNA；确保从上清液中纯化 DNA。
使用 Nanodrop 或 Qubit TM DNA 试剂定量 DNA。
® Ultralow V2 DNA-Seq 文库制备试剂盒，使用 100 pg – 10 ng 的纯化 DNA 制作可测序的 MapR 文库。

数据分析

笔记：
在此示例中，我们使用黑腹果蝇参考基因组“BDGP Release 6 + ISO1 MT/dm6”或 dm6，可在https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/dm6/bigZips/获得。
在命令行中运行的代码以 $ 开头。

比对到参考基因组
使用 Bowtie2 索引参考基因组
$ bowtie2-build --threads [# of threads/cores] [参考基因组 fasta 文件] [用于命名索引文件的文件名]
下面是使用 64 个线程运行 bowtie2-build 命令并使用名为“dm6.fa”的参考基因组 fasta 文件后前 20 行的屏幕截图。 dm6 将用作索引文件的文件名。

将原始/干净的测序读数与参考基因组对齐（通过管道直接生成 BAM 文件而不是 SAM）。
$ bowtie2 -p [# of threads/cores] --sensitive -x [在步骤 1 中指定的索引] -1 CleanReads_1.fq -2 CleanReads_2.fq | samtools view -@ [# of threads/cores] -bSo Output.bam
按基因组坐标对 BAM 文件进行排序（使用 deepTools 生成 bigwig 文件需要此步骤）
$ samtools sort -@ [# of threads/cores] -o Output_sorted.bam Output.bam
用于数据可视化的 Bigwig 生成
-使用深度工具
$ bamCoverage -b BAMfile.bam -o output_file.bw -bs [bin size] -p [# of threads/cores] --normalizeUsing CPM

基因组浏览器检查

图 2. 使用或不使用 RNAse H1 预处理的 MapR 数据的基因组浏览器检查。
数据在基因组浏览器（例如 Integrative Genomics Browser，或 IGV）中使用每百万计数 (CPM) 标准化的大人物文件进行可视化。为了比较富集，两条轨道都被缩放到相同的值。

笔记

传统的 MapR 包含 R 环富集的控制，其中一部分珠结合核与 GST-MNase 一起孵育。在这个实验条件下，研究人员可以控制随机 MNase 与染色质或背景的结合。出乎意料的是，我们无法让 MNase 控件工作。我们在进行实验时没有获得可纯化的 DNA。对于纯化 DNA 的定量，我们使用了 High Sensitivity QubitTM，它可以定量少量的 DNA（皮克）。因此，我们进行了额外的控制，在执行 MapR 之前，我们用催化活性 RNAse H1 处理了一小部分珠结合核 3 小时。
用于数据可视化的分析大人物文件从 Gene Expression Omnibus (GEO) 下载，登录代码 GSE174488。它们对应于来自黑腹果蝇感光神经元的 MapR，如Jauregui-Lozano 等人最初所述。（2022 年）。

食谱

GST-洗涤/平衡缓冲液
试剂最终浓度数量
Tris (1 M pH 7.5)125 毫米1,250 µL
氯化钠 (5 M)150 毫米300 µL
数字地面电视 (100 毫米)1毫米100 µL
EDTA (500 毫米)1毫米20 µL
H 2 O
全部的不适用毫升
10 毫升

GST 洗脱缓冲液
试剂最终浓度数量
谷胱甘肽（还原）（1 M）50毫米500 µL
GST-洗涤/平衡缓冲液
全部的不适用9.5 毫升
10 毫升

考马斯固色液
试剂最终浓度数量
甲醇50%50 毫升
冰醋酸
H 2 O
全部的10%10 毫升
40 毫升
100 毫升

考马斯染色溶液
试剂最终浓度数量
考马斯亮蓝0.10.1克
甲醇
冰醋酸
H 2 O
全部的50%
10%50 毫升
10 毫升
40 毫升
100 毫升
或者，您可以制作 10% 考马斯蓝储备溶液（1 g 考马斯试剂 + 10 mL H 2 O），然后将 1 mL 的 10% 储备溶液添加到考马斯染色溶液中。

考马斯脱色液
试剂最终浓度数量
甲醇40%40 毫升
冰醋酸
H 2 O
全部的10%10 毫升
50 毫升
100 毫升

均质化/洗涤缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1M, pH 7.5)40毫米400 µL
氯化钾 (1M)120 毫米1.2 毫升
NP-40 (10%)0.4%400 µL
H 2 O不适用8 毫升
全部的10 毫升

稀释缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1 M, pH 7.5)40毫米400 µL
氯化钾 (1 M)120 毫米1.2 毫升
H 2 O不适用8.4 毫升
全部的10 毫升

珠洗缓冲液
试剂最终浓度数量
氯化镁22.5 毫米25 µL
PBST (1 × )不适用9.975 毫升
全部的10 毫升

PBST (1 × , pH 7.4)
试剂最终浓度数量
PBS (10 × )1 ×5 毫升
吐温0.1%50 µL
H 2 O不适用44.950 毫升
全部的50 毫升

挖洗缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1 M, pH 7.5)20毫米1毫升
亚精胺（6.4 M，pH 7.0）0.5 毫米3.9 µL
氯化钠 (5 M)150 毫米1.5 毫升
H 2 O
全部的不适用47.5 毫升
50 毫升

低盐冲洗缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1 M, pH 7.5)20毫米200 µL
亚精胺 (6.4 M)0.5 毫米0.8 µL
洋地黄皂苷 (5%)0.05%100 µL
H 2 O不适用9.62 毫升
全部的不适用10 毫升

激活缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1 M, pH 7.5)3.5 毫米14 µL
氯化钙 (100 毫米)10毫米400 µL
洋地黄皂苷 (5%)0.05%40 µL
H 2 O不适用3.46 毫升
全部的不适用4 毫升

EGTA-STOP 缓冲器 (1 × )
试剂最终浓度数量
氯化钠 (5M)170 毫米34 µL
EGTA (100 毫米)20毫米200 µL
洋地黄皂苷 (5%)0.05%10 µL
RN酶 A (10 µg/µL)0.05%5 µL
线性丙烯酰胺 (5 µg/µL)0.025%5 µL
H 2 O不适用746 µL
全部的不适用1毫升

致谢

这项研究得到了美国国立卫生研究院 - 国家眼科研究所授予 R21 EY031024 的支持。该协议描述了 Jauregui-Lozano 等人的研究论文 (DOI: 10.1111/acel.13554) 中使用的方法。（2022 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。

参考

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García-Muse , T. 和 Aguilera, A. (2019)。 R 循环：从生理到病理角色。单元格179（3）：604-618。
Jauregui-Lozano, J.、Bakhle, K. 和 Weake, VM (2021)。使用 GFP 标记的细胞核对黑腹果蝇进行体内组织特异性染色质分析。遗传学218（3）。
Jauregui-Lozano, J.、Escobedo, S.、Easton, A.、Lanman, NA、Weake, VM 和 Hall, H. (2022)。在衰老过程中维持基因表达和神经元功能需要适当控制 R 环稳态。老化细胞21(2)：e13554。
Langmead, B. 和 Salzberg, SL (2012)。使用 Bowtie 2 进行快速间隙读取对齐。 Nat 方法9（4）：357-359。
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Meers, MP, Bryson, TD, Henikoff, JG 和 Henikoff, S. (2019)。改进了 CUT&RUN 染色质分析工具。生命8： e46314 。
Ramírez , F.、Dundar, F.、Diehl, S.、Gruning, BA 和 Manke, T. (2014)。 deepTools：探索深度测序数据的灵活平台。 Nucleic Acids Res 42（网络服务器问题）：W187-191。
Salvi, JS 和 Mekhail, K. (2015)。 R 环突出显示 ALS 中的细胞核。核心6（1）：23-29。
Thorvaldsdóttir , H., Robinson, JT 和 Mesirov, JP (2013)。 Integrative Genomics Viewer (IGV)：高性能基因组数据可视化和探索。简要 Bioinform 14（2）：178-192。
Wang, K., Wang, H., Li, C., Yin, Z., Xiao, R., Li, Q., Xiang, Y., Wang, W., Huang, J., Chen, L.,等。（2021 年）。使用 DNA-RNA 杂交识别传感器对天然 R 环进行基因组分析。科学进阶7（8）：eabe3516。
Yan, Q. 和 Sarma, K. (2020)。 MapR：一种识别原生 R 循环全基因组的方法。 Curr Protoc Mol Biol 130（1）：e113。

材料和试剂

5 或 15 mL 锥形管
40 µm 细胞过滤器（Corning，目录号：431750）
Slide-A-Lyzer TM G2 透析盒，10K MWCO，3 mL（Thermo Fisher，目录号：87730）
Pierce TM谷胱甘肽磁性琼脂糖珠（Thermo Fisher，目录号：78601）。保持在 4 °C
One Shot BL21（DE3）化学感受态大肠杆菌（Thermo Fisher，目录号：C600003）。将未使用的大肠杆菌颗粒保持在 -80 °C
L-谷胱甘肽还原（Millipore Sigma，目录号：G4251-300MG）
HyperPAGE II 预染色蛋白标记物（Bioline，目录号：BIO-33066）。将等分试样保持在 -20 °C
Dynabeads TM蛋白 G（Invitrogen，目录号：10003D）。保持在 4 °C
抗 GFP 抗体（Sigma-Aldrich，目录号：11814460001）。重悬后保持在-20°C
UAS-EGFP.KASH-Msp300 苍蝇（布卢明顿果蝇股票中心，BDSC#92580）
Digitonin 5％（Thermo Fisher，目录号：BN2006）
UltraPure TM二硫苏糖醇 (DTT) 0.1 M 溶液（Thermo Scientific，目录号 707265ML）
UltraPure TM乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）（Thermo Fisher，目录号：15576028）
UltraPure TM 1 M Tris-HCl，pH 8.0（Invitrogen，目录号 15568025）
EGTA，分子生物学级（Millipore，目录号：324626）
cOmplete TM ，迷你，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Roche，目录号：04693159001）
Corning ® 100 mL HEPES，液体 1 M 溶液（238.3 mg/mL）（Corning，目录号：25-060-CI）
IGEPAL ® CA-630（Supelco，目录号：56741-50ML-F）
TWEEN ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
考马斯亮蓝 R-250 染料（Thermo Scientific，目录号：20278）
冰醋酸，ReagentPlus ® （Sigma-Aldrich，目录号 A6283）
甲醇，ACS 试剂（Sigma-Aldrich，目录号 179337）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S022-1G）
RNase A（Thermo Fisher，目录号：12091021）
线性丙烯酰胺（Thermo Fisher，目录号：AM9520）
RNase H（New England BioLabs，目录号 M0297S）。保持在-20°C
ChIP DNA Clean & Concentrator（Zymo，目录号 D5205）
Qubit TM 1 × dsDNA 高灵敏度（HS）（Thermo Fisher，目录号：Q33230）
注意：我们建议使用高灵敏度检测，因为获得的 DNA 输入量低且难以使用传统试剂进行量化。
Ovation ®超低 V2 DNA-Seq 文库制备试剂盒（Tecan，目录号：0344NB-08）
GST-洗涤/平衡缓冲液（见配方）
GST 洗脱缓冲液（参见配方）
考马斯定影液（见配方）
考马斯染色溶液（见配方）
考马斯脱色溶液（见配方）
均质化/洗涤缓冲液（参见配方）
稀释缓冲液（见配方）
珠子洗涤缓冲液（见配方）
PBST (1 × , pH 7.4) (见食谱)
挖洗缓冲液（见配方）
低盐冲洗缓冲液（见配方）
激活缓冲液（见配方）
EGTA-STOP 缓冲器 (1 × )（见配方）

设备

必能信扩音器
安捷伦 TapeStation 4200
WHEATON ® Dounce 组织研磨机，1 mL
37°C培养箱（如Thomas Scientific SCO2W台式水套CO 2培养箱，目录号：1229P58）
冷 (4 °C) 离心机（例如 Eppendorf TM ，型号： Centrifuge 5424 R）
冷（4°C）培养箱（如Fisherbrand TM mini低温冷藏培养箱，目录号： 15-015-2632）
管旋转器旋转器（例如 Thermo Scientific TM管旋转器旋转器，目录号：88881001）
磁架（如 Millipore PureProteome TM磁架，目录号：LSKMAGS08）
凝胶电泳室（如 Bio-Rad Mini-PROTEAN ® tetra 垂直电泳槽，目录号：1658025FC）

软件

测序读数的基因组比对：Bowtie2 (Langmead and Salzberg, 2012)
BAM 文件处理：Samtools (Li et al., 2009)
Bigwig 生成/处理：Deeptools (Ramírez et al., 2014)
综合基因组浏览器（Thorvaldsdóttir 等人，2013 年）

程序

大肠杆菌转化和蛋白质纯化
对于该协议，我们执行了大肠杆菌转化和蛋白质过表达诱导，如原始 MapR 方法论文（Yan 和 Sarma，2020）中所述。我们还在Jauregui-Lozano 等人中描述了这些步骤。（2022 年）。
使用 10 ng 质粒并按照 New England Biolabs 的制造商说明转化 BL21 DE3 细胞。
在 37°C 下将 LB 培养基板中的板转化细胞过夜。
在 37°C 和 225 rpm 的条件下，选择单个菌落并在补充有羧苄青霉素 (1 μ g/mL) 的液体 LB 培养基中生长。
第二天，将 4.5 mL 的液体培养物添加到 495 mL 的液体 LB 培养基中，辅以羧苄青霉素，并在 37°C 和 225 rpm 下孵育 2-4 小时。孵育 2 小时后，检查液体培养的等分试样的光密度，直到用分光光度计测量达到 0.6。
通过将 IPTG 添加到 0.5 mM 的最终浓度来诱导蛋白质表达。
在 37°C 和 225 rpm 下孵育含 IPTG 的液体培养 3 小时。
准备新鲜的 GST 洗涤/平衡缓冲液和 GST 洗脱缓冲液。
在冷离心机中以 8,000 × g离心细菌裂解物 10 分钟。
用 cOmplete TM蛋白酶抑制剂去除上清液并在 5 mL 的冷 PBS 缓冲液中重新悬浮细菌颗粒。
使用振幅为 20% 的Branson 声音放大器和 5 个 15 秒开到 45 秒关的周期进行声波处理。确保在超声处理期间含有细菌裂解物的锥形管在冰上。
× g下离心 20 分钟。
将可溶性裂解物转移到新的 5 或 15 mL 锥形管中。
平衡 1 mL 的 Pierce TM谷胱甘肽磁性琼脂糖珠 GST。
涡旋 10 s，放置在磁铁上，去除上清液，并添加 1 mL 的洗涤/平衡缓冲液。
将 DTT 和 EDTA 添加到可溶性裂解物中（每个最终 1 mM）。
从珠子中去除上清液并将珠子转移到可溶性裂解物中。
在 4 °C 下持续旋转孵育 1-2小时。
使用磁铁，去除上清液并加入 1 mL 的洗涤缓冲液。将 20 – 50 μ L 的上清液保存为“流穿”样品，以供以后运行 SDS 页时使用。
在 4°C 下孵育并不断旋转。
使用磁铁去除洗涤缓冲液并再重复洗涤步骤两次。
去除洗涤缓冲液并添加 250 μL 的 GST 洗脱缓冲液。
在 4°C 下持续旋转孵育 10 分钟。
收集洗脱液 #1 [e#1] 并再重复洗脱步骤两次。
向每个 250 μL 洗脱液中加入 41 μL先前重悬于 GST 洗脱缓冲液中的 7 × cOmplete TM蛋白酶抑制剂。
运行带有流通和洗脱物的 SDS 页以评估纯化效率（图 1）。

图 1. 考马斯染色 SDS 页评估纯化效率。
使用 SDS 页评估 GST 蛋白质纯化的效率，然后用考马斯蓝染色。对于流穿 (FT)，上样 20 μ g 蛋白质；对于洗脱部分，上样2 μ g 蛋白质。 GST-ΔRH-MNase 的大小约为 60 kDa，而 GST-MNase 的大小约为 40 kDa。

运行 SDS-page 后，将凝胶转移到考马斯固定液中 30 分钟，然后放入摇杆中。
将固定凝胶转移到考马斯染色溶液中 1 小时，然后放入摇杆中。
将染色的凝胶转移到考马斯脱色溶液中 20 分钟，然后放入摇杆中。
更换考马斯脱色溶液，并置于摇杆中。
重复步骤 28 和 29 两次（总共 1 小时 20 分钟脱色）。 GST-MNase 的分子量接近 40 kDa，而 GST-ΔRH-MNase 的分子量接近 60 kDa。
透析蛋白质，加入甘油保存在-20°C，并根据原始MapR方法（Yan和Sarma，2020）定量蛋白质。

样品制备
果蝇中纯化组织特异性细胞核，请按如下方式进行细胞核免疫富集：对于本协议，我们从 UAS-EGFP.KASH-Msp300 果蝇中进行组织特异性细胞核免疫沉淀（可在布卢明顿果蝇库存中心获得，参见方法）。这些果蝇在与 Gal4 飞线交叉时，会在特定组织中表达锚定在外核膜上的 GFP。然后，可以使用磁珠和 GFP 抗体来纯化这些细胞核。我们还描述了这些步骤(Jauregui-Lozano et al., 2021) ，并且这种方法与不同的染色质分析技术兼容。
准备新鲜的珠子洗涤缓冲液、均质/洗涤缓冲液和稀释缓冲液并保持在冰上。
在室温 (RT) 下以恒定旋转在 1 mL 的珠子洗涤缓冲液中孵育 40 μL 的Dynabeads TM 10 分钟。
将管子转移到磁性架子上。将机架倒置数次以确保所有珠子都与磁铁结合。用移液器去除上清液。
µg 抗 GFP 抗体在 1 mL 珠子洗涤缓冲液中重悬珠子。
在 RT 中孵育珠子 30 分钟，不断旋转以与 GFP 抗体结合。
使用磁铁，去除上清液。
用 1 mL 珠子洗涤缓冲液在 RT 中以恒定旋转洗涤珠子 5 分钟。
使用磁铁，去除上清液。
在 0.1% NP-40 均质/洗涤缓冲液中重悬珠子。将三份稀释缓冲液与一份均质化/洗涤缓冲液混合，最终浓度为 0.1% NP-40。
用 1 mL 的均质/洗涤缓冲液加载 Dounce 均质机。将均质器放在冰上。
将果蝇样品转移到均质器中。
400 个飞头（在液氮中快速冷冻并储存在 -80°C）可与 1 mL 的均质化/洗涤缓冲液一起使用，以从成人头部的神经元组织中分离细胞核。
也可以使用新鲜样品，例如幼虫组织或整个胚胎。
用 5 次“松散”的杵敲击研磨样品。
在冰上孵育样品 5 分钟。
用另外 5 次“松”杵敲击，然后再用 10 次“紧”杵敲击研磨样品。
使用 40 μm 细胞过滤器过滤飞匀浆。
将 3 mL 的稀释缓冲液添加到过滤的 1 mL 匀浆中，最终浓度为 0.1% NP-40。
将 4 mL 的匀浆均匀地分成四个 1.5 mL 管（每管 1 mL）。
加入 50 μL 的珠子/抗体溶液。
在 RT 中用珠子/抗体溶液孵育飞匀浆 30 分钟，并不断旋转以将细胞核与抗 GFP 珠子耦合。
使用磁铁，去除上清液。
将所有四个管中的珠结合核结合到 1 mL 的 0.1% NP-40 均质/洗涤缓冲液中。
在 4°C 下持续旋转孵育 5 分钟。
使用磁铁，去除上清液。
在 1 mL 的 0.1% NP-40 均质/洗涤缓冲液中重新悬浮珠结合核，并转移到新的 1.5 mL 管中。
在 4°C 下持续旋转孵育 5 分钟。
使用磁铁，去除上清液。
在 4°C 下以恒定旋转在 1 mL 的 0.1% NP-40 均质/洗涤缓冲液中清洗珠结合核 5 分钟。
注意：如前所述(Jauregui-Lozano et al., 2021) ，此方法将产生适用于 MapR 的珠结合核。否则，如原始 MapR 方法（Yan 和 Sarma，2020）中所述，使用涂有伴刀豆球蛋白 A 的珠子纯化细胞核。

修改后的 MapR
用 1 mL 的挖掘洗涤缓冲液清洗珠结合核。
对于每个洗涤步骤，在 4°C 下孵育珠结合核 5 分钟，并持续旋转。
使用磁铁，去除 dig-wash 缓冲液，然后再重复两次洗涤步骤。
在 150 μL 的 dig-wash 缓冲液中重新悬浮珠结合核。
添加 GST-ΔRH-MNase 或 GST-MNase 至最终浓度为 1 μM。
要根据蛋白质浓度计算蛋白质摩尔浓度，请使用以下公式：

μM=(μg/mL)/(MW(kDa))

在哪里，
μg/mL 是使用传统蛋白质定量试剂获得的蛋白质浓度，例如 Bradford Assay 或 Qubit TM蛋白质测定试剂盒 (Thermo Fisher)。
MW (kDa) 是蛋白质的分子量。 GST-MNase 的 MW 为 44 kDa，GST-dRH-MNase 的 MW 为 61.5 kDa。
Bioline 网站有一个在线计算器来执行此计算： https ://www.bioline.com/media/calculator/01_04.html 。
在 4°C 下孵育，持续旋转 1 小时。
用 500 μL 的 dig-wash 缓冲液清洗珠结合核 3 次。
用低盐冲洗缓冲液清洗珠结合核一次。
在 200 μL 冰冷的含钙活化缓冲液中重新悬浮珠结合核，并在湿冰上放置 60 秒。
使用磁铁，去除上清液并立即加入 150 μL EGTA-STOP 缓冲液。
在 37°C 下孵育 30 分钟。
使用磁铁，将上清液转移到新试管中，并使用 ChIP DNA clean & concentrator 从上清液中提取 DNA。上清液含有释放的富含 R 环的 DNA；确保从上清液中纯化 DNA。
使用 Nanodrop 或 Qubit TM DNA 试剂定量 DNA。
® Ultralow V2 DNA-Seq 文库制备试剂盒，使用 100 pg – 10 ng 的纯化 DNA 制作可测序的 MapR 文库。

数据分析

笔记：
在此示例中，我们使用黑腹果蝇参考基因组“BDGP Release 6 + ISO1 MT/dm6”或 dm6，可在https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/dm6/bigZips/获得。
在命令行中运行的代码以 $ 开头。

比对到参考基因组
使用 Bowtie2 索引参考基因组
$ bowtie2-build --threads [# of threads/cores] [参考基因组 fasta 文件] [用于命名索引文件的文件名]
下面是使用 64 个线程运行 bowtie2-build 命令并使用名为“dm6.fa”的参考基因组 fasta 文件后前 20 行的屏幕截图。 dm6 将用作索引文件的文件名。

将原始/干净的测序读数与参考基因组对齐（通过管道直接生成 BAM 文件而不是 SAM）。
$ bowtie2 -p [# of threads/cores] --sensitive -x [在步骤 1 中指定的索引] -1 CleanReads_1.fq -2 CleanReads_2.fq | samtools view -@ [# of threads/cores] -bSo Output.bam
按基因组坐标对 BAM 文件进行排序（使用 deepTools 生成 bigwig 文件需要此步骤）
$ samtools sort -@ [# of threads/cores] -o Output_sorted.bam Output.bam
用于数据可视化的 Bigwig 生成
-使用深度工具
$ bamCoverage -b BAMfile.bam -o output_file.bw -bs [bin size] -p [# of threads/cores] --normalizeUsing CPM

基因组浏览器检查

图 2. 使用或不使用 RNAse H1 预处理的 MapR 数据的基因组浏览器检查。
数据在基因组浏览器（例如 Integrative Genomics Browser，或 IGV）中使用每百万计数 (CPM) 标准化的大人物文件进行可视化。为了比较富集，两条轨道都被缩放到相同的值。

笔记

传统的 MapR 包含 R 环富集的控制，其中一部分珠结合核与 GST-MNase 一起孵育。在这个实验条件下，研究人员可以控制随机 MNase 与染色质或背景的结合。出乎意料的是，我们无法让 MNase 控件工作。我们在进行实验时没有获得可纯化的 DNA。对于纯化 DNA 的定量，我们使用了 High Sensitivity QubitTM，它可以定量少量的 DNA（皮克）。因此，我们进行了额外的控制，在执行 MapR 之前，我们用催化活性 RNAse H1 处理了一小部分珠结合核 3 小时。
用于数据可视化的分析大人物文件从 Gene Expression Omnibus (GEO) 下载，登录代码 GSE174488。它们对应于来自黑腹果蝇感光神经元的 MapR，如Jauregui-Lozano 等人最初所述。（2022 年）。

食谱

GST-洗涤/平衡缓冲液
试剂最终浓度数量
Tris (1 M pH 7.5)125 毫米1,250 µL
氯化钠 (5 M)150 毫米300 µL
数字地面电视 (100 毫米)1毫米100 µL
EDTA (500 毫米)1毫米20 µL
H 2 O
全部的不适用毫升
10 毫升

GST 洗脱缓冲液
试剂最终浓度数量
谷胱甘肽（还原）（1 M）50毫米500 µL
GST-洗涤/平衡缓冲液
全部的不适用9.5 毫升
10 毫升

考马斯固色液
试剂最终浓度数量
甲醇50%50 毫升
冰醋酸
H 2 O
全部的10%10 毫升
40 毫升
100 毫升

考马斯染色溶液
试剂最终浓度数量
考马斯亮蓝0.10.1克
甲醇
冰醋酸
H 2 O
全部的50%
10%50 毫升
10 毫升
40 毫升
100 毫升
或者，您可以制作 10% 考马斯蓝储备溶液（1 g 考马斯试剂 + 10 mL H 2 O），然后将 1 mL 的 10% 储备溶液添加到考马斯染色溶液中。

考马斯脱色液
试剂最终浓度数量
甲醇40%40 毫升
冰醋酸
H 2 O
全部的10%10 毫升
50 毫升
100 毫升

均质化/洗涤缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1M, pH 7.5)40毫米400 µL
氯化钾 (1M)120 毫米1.2 毫升
NP-40 (10%)0.4%400 µL
H 2 O不适用8 毫升
全部的10 毫升

稀释缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1 M, pH 7.5)40毫米400 µL
氯化钾 (1 M)120 毫米1.2 毫升
H 2 O不适用8.4 毫升
全部的10 毫升

珠洗缓冲液
试剂最终浓度数量
氯化镁22.5 毫米25 µL
PBST (1 × )不适用9.975 毫升
全部的10 毫升

PBST (1 × , pH 7.4)
试剂最终浓度数量
PBS (10 × )1 ×5 毫升
吐温0.1%50 µL
H 2 O不适用44.950 毫升
全部的50 毫升

挖洗缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1 M, pH 7.5)20毫米1毫升
亚精胺（6.4 M，pH 7.0）0.5 毫米3.9 µL
氯化钠 (5 M)150 毫米1.5 毫升
H 2 O
全部的不适用47.5 毫升
50 毫升

低盐冲洗缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1 M, pH 7.5)20毫米200 µL
亚精胺 (6.4 M)0.5 毫米0.8 µL
洋地黄皂苷 (5%)0.05%100 µL
H 2 O不适用9.62 毫升
全部的不适用10 毫升

激活缓冲液
试剂最终浓度数量
HEPES (1 M, pH 7.5)3.5 毫米14 µL
氯化钙 (100 毫米)10毫米400 µL
洋地黄皂苷 (5%)0.05%40 µL
H 2 O不适用3.46 毫升
全部的不适用4 毫升

EGTA-STOP 缓冲器 (1 × )
试剂最终浓度数量
氯化钠 (5M)170 毫米34 µL
EGTA (100 毫米)20毫米200 µL
洋地黄皂苷 (5%)0.05%10 µL
RN酶 A (10 µg/µL)0.05%5 µL
线性丙烯酰胺 (5 µg/µL)0.025%5 µL
H 2 O不适用746 µL
全部的不适用1毫升

致谢

这项研究得到了美国国立卫生研究院 - 国家眼科研究所授予 R21 EY031024 的支持。该协议描述了 Jauregui-Lozano 等人的研究论文 (DOI: 10.1111/acel.13554) 中使用的方法。（2022 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。

参考

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