材料和试剂

1. Amicon Ultra-4 30 kDa 或 50 kDa 超滤装置（Millipore-Sigma，目录号：UFC803024 和 UFC805024）

2. 磷脂（Avanti Polar Lipids, Inc.）

a. DOTAP：1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane（氯化物盐；Avanti Polar Lipids，目录号：890890C-200 mg）以 100 mg 份的形式提供，溶解在 25 mg/mL 的氯仿中（FW 698.5；35.8 mM） .

b. DOPC：1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（Avanti Polar Lipids，目录号：850375C-500 mg）以 100 mg 份的形式提供，以 25 mg/mL（FW 786.1；31.8 mM）溶解在氯仿中。

3. 单分散二氧化硅颗粒 [70 nm 直径； 25 mg/mL 水性悬浮液（0.11 μM；7 × 10 ^{13 个}粒子/mL）；密度= 2.0 g/cm ³]得自DiagNano（CD Bioparticles，目录号：DNG-B004）。

4. 如前所述(Pentia et al ., 2005)制备纯化的 PDE6，并在 -20 °C 下储存在 PDE6 储存缓冲液中。

5. 纯化的 Gtα-GDP或纯化的 Gtα*-GTPγS (Ting et al ., 1993; Irwin et al ., 2019) ，并在 -20 °C下储存在 Gtα 储存缓冲液中。

6. NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶（Invitrogen，目录号：NP0321BOX）

7. 双（磺基琥珀酰亚胺）辛二酸（BS3）（Thermo Scientific，目录号：21580）

8. NaCl（电子显微镜科学，目录号：EM-7760）

9. MgCl ₂·6H ₂O（电子显微镜科学，目录号：EM-5980）

10. 二硫苏糖醇（电子显微镜科学，目录号：EM-3860）

11. 甘油（IBI Scientific，目录号：IB15760）

12. Tris 基（JT Baker，目录号：JT4109）

13. AlCl ₃·6H ₂O（Millipore Sigma，目录号：A0718）

14. NaF（JT Baker，目录号：JT3689）

15. HEPES，半钠盐（MP Biomedicals，目录号：IC15245180）

16. 鸟苷-5'-二磷酸钠盐（Millipore Sigma，目录号：G7127）

17. HNM 缓冲液（见配方）

18. PDE6 存储缓冲区（参见配方）

19. Gtα存储缓冲区（见配方）

20. 745 µM AlCl ₃在 HNM 缓冲液中（见配方）

21. HNM 缓冲液中的 250 mM NaF（参见食谱）

22. 1 M氯化镁₂ （见食谱）

23. 50 mM GDP（见配方）

24. 10 mM BS3（见配方）

25. 0.5 mM BS3（见配方）

设备

1. Eppendorf 5415D 离心机

2. 涡流混合器（VWR，目录号：10153-838）

3. Avanti Mini Extruder Set （Avanti ，目录号： 610023）

a. 0.1 µm，19 mm 直径的聚碳酸酯膜（Avanti，目录号： 610005 或 Whatman目录号： 800309）

b. 10 mm 过滤器支架（Avanti，目录号： 610014）

c. 1000 μL 气密注射器（Avanti，目录号：610017）

程序

A. 磷脂的制备

将 1.26 mL DOPC（31.5 mg，40 µmol）和 279 µL DOTAP（7.0 mg，10 µmol）与 461 µL 氯仿混合制备80:20 摩尔比的 DOPC:DOTAP （Melia等人，2000） .

[DOPC] = 20.0 毫米，[DOTAP] = 5.0 毫米；总 [磷脂] = 25.0 mM

将 200 μL 部分（4.0 μmol DOPC 和 1 μmol DOTAP）等分到玻璃管中，并在氮气流下蒸发。

干燥的脂质在-20 °C的黑暗中储存长达六个月，直到使用。

B. 二氧化硅纳米粒子的制备

× 10 ¹³颗粒）二氧化硅颗粒与 1 mL 95% 乙醇混合来分解二氧化硅颗粒。

以最大速度涡旋 2 分钟。

在室温下孵育至少 1 小时（最好过夜）。

在 Eppendorf 5415D 离心机中，在 10 °C 下以 10,000 × g离心二氧化硅悬浮液 10 分钟。

用 1.0 mL 的冰冷 HNM 缓冲液重新悬浮颗粒，涡旋 2 分钟，然后在 10 °C的 Eppendorf 5415D 离心机中以 10,000 × g再次离心 10 分钟，以去除残留的乙醇。

用 1.0 mL 的冰冷 HNM 缓冲液重新悬浮颗粒，涡旋 2 分钟，并保持在冰上直至使用。

C. 脂珠的制备

1. 干燥的 DOPC/DOTAP 脂质混合物在室温下在没有氮气的情况下与二氧化硅颗粒悬浮液混合，轻轻涡旋（设置 #5-6）2 分钟，然后静置 1 分钟。这个过程再重复四次。

最终浓度：80:20 DOPC:DOTAP = 5 mM（总磷脂），[脂珠] = 23 nM

2. 组装微型挤出机（制造商创建的描述微型挤出机组装的视频可在此处找到： https ://www.youtube.com/watch?v=8ei62ZmLgSM ）：

a. 用 HNM 缓冲液预润湿两个 10 mm 过滤器支架，并将一个置于内部膜支架的 O 形环内。

b. 将膜支架放入外壳中。

c. 将单个聚碳酸酯 0.1 µm 膜放在膜支架的顶部。

d. 将第二个过滤器支架放在第二个膜支架上，然后将第二个膜支架放入外壳中（O 形环相互面对）。

e. 将 Teflon 轴承放入固定螺母中。

f. 用手将固定螺母拧紧到外壳上。

g. 将空的气密注射器连接到 Mini Extruder 的一端。

h. 通过使用第二个气密注射器将 HNM 缓冲液通过迷你挤出机预润湿组件。

3. 通过迷你挤出机挤出脂质/二氧化硅悬浮液：

a. 将脂质/二氧化硅混合物装入其中一个气密注射器中。

b. 用力压下注射器筒，迫使脂珠快速穿过膜（每个周期持续约 10 秒）

c. 总共重复 15 次，脂质珠悬浮液最终填充原来空的注射器（这可以防止从未通过过滤器的聚集体被回收）。

4. 在 Eppendorf 5415 D 离心机中，在室温下以 10,000 × g离心 10 分钟，从注射器中回收的单层脂珠与未结合的磷脂分离。

5. 用 500 μL 的 HNM 缓冲液重新悬浮颗粒，脂珠浓度为 46 nM。

6. 如果在室温下避光储存，脂质珠制剂可稳定约 2 天。

D. 将 PDE6 与脂珠结合

将 10 μL 的 46 nM 脂珠制剂（0.46 pmol）添加到纯化的 PDE6 全酶中，并在室温下孵育 30 分钟。

添加到脂珠制剂中的 PDE6 的量可以从 10 fmol（1 nM 浓度）变化到至少 10 pmol（1 μM 浓度），而不会超过脂珠的最大结合能力。如步骤G2b 中所述确定添加到脂珠中的 PDE6 的量。

PDE6 原液的甘油浓度必须低于 10% (v/v)，以实现与脂珠的最佳结合。

为了降低甘油浓度，可以使用 50 kDa MWCO Amicon Ultra-4 过滤装置更换 PDE6 储备溶液的缓冲液。用 HNM 缓冲液将蛋白质稀释 10 倍以上，然后以 3,000 × g离心10-20 分钟。离心时间将取决于蛋白质的初始体积。

°C )的 Eppendorf 离心机中以 10,000 × g旋转 PDE6-脂珠混合物10 分钟。

离心后尽快去除上清液，因为颗粒会随着时间的推移而松动。

为了确定 PDE6 与脂珠结合的程度，可以回收并分析上清液。如图 2 所示，在 0.01 至 10 pmol 添加的 PDE6 范围内，85 ± 6% 与脂珠结合。

图 2. PDE6 与脂珠的结合。

将脂珠 (0.46 pmol) 与 40 μL 指定量的 PDE6 混合并孵育 30 分钟。离心后，测定上清液部分的 PDE6 活性（参见步骤 G2b），以计算与脂珠结合的总 PDE6 活性的百分比。数据代表平均值 ± SD (n = 3)。

使用含有结合 PDE6 的脂珠颗粒与 Gtα* 进行后续孵育。

E. 氟化铝活化 Gtα* (Gtα-GDP-AlF ₄^-)的制备

1. 对于储存在 50% (v/v) 甘油中的 Gα-GDP 制剂，首先通过使用 HNM 缓冲液和超滤的缓冲液交换降低甘油浓度。

a. Gtα 制剂的甘油浓度必须低于 10% (v/v)，以实现与脂珠的最佳结合。

b. 通过首先用 HNM 缓冲液将 Gtα 储备溶液稀释 10 倍以上，将蛋白质样品置于 30 kDa MWCO Amicon Ultra-4 过滤装置的上腔室中，并以 3,000 × g离心10-20 分钟来进行缓冲液交换（取决于稀释蛋白质的初始体积）。

2. 纯化的 Gtα-GDP 通过添加氟化铝被激活（Bigay等人，1987）。在 50 μL 的最终体积中，添加以下内容：

a. Gtα 储存缓冲液中的 45.6 μL Gtα-GDP [含有 <10% (v/v) 最终甘油浓度]。

b. 2.0 µL 的 745 µM AlCl ₃（最终浓度 = 30 µM）。

c. 2.0 µL 的 250 mM NaF（最终浓度 = 10 mM）。

d. 0.4 µL 的 1 M MgCl ₂（最终浓度 = 8 mM）。

e. 在冰上孵育 15-30 分钟。

F. Gtα*-PDE6 复合物在脂珠上的形成

将 50 μL 的 Gtα*（Gtα-GDP-AlF ₄^-或 Gtα-GTPγS）添加到含有 PDE6 的脂珠颗粒中，混合均匀，然后在室温下孵育 45 分钟。

添加到与 PDE6 结合的脂珠中的 Gtα* 浓度可以变化，最大可达约 5 μM（这是添加到脂珠混合物中的纯化 Gtα 的溶解度极限）。

对于化学交联实验（参见图 3），在离心前将交联剂添加到脂珠悬浮液中。从 0.5 mM 工作溶液或 10 mM 储备溶液中添加 BS3 至 0.125 mM 的最终浓度。让交联反应在室温下进行 45 分钟，然后以 10,000 × g离心10 分钟。在 SDS-PAGE 的 1 ×凝胶上样缓冲液中重新悬浮颗粒。

对于 PDE6 的 cGMP 水解酶促测定（参见图 4），在添加 cGMP 底物以启动 PDE6 水解活性测定之前，不离心含有 Gtα*-PDE6 的脂珠。

图 3. Gtα 和 PDE6 活化复合物的化学交联。

PDE6 和 Gtα* 的交联通过首先将 9 pmol PDE6 与 0.46 pmol 脂珠结合 20 分钟，然后离心来进行。脂质沉淀用 115 pmol Gtα-GDP-ALF 重新悬浮，孵育 45 分钟，然后离心。将颗粒重新悬浮在 20 μL 含有 0.125 mM BS3 的 HNM 缓冲液中，并进行 45 分钟的交联。泳道 A 包含纯化的 PDE6，泳道 B 包含纯化的 Gtα*，泳道 C 包含交联混合物。

G. 分析方法

1. 蛋白质浓度的测定

PDE6 或 Gtα 的浓度是按照制造商的方案通过二辛可宁测定法 (Thermo Fisher, Inc.) 确定的。

对于含有过量未结合核苷酸的 Gtα 样品的分析，使用 Amicon Ultra-4 30 kDa 超滤装置（按照步骤 E1b 中描述的程序）与缺乏鸟嘌呤核苷酸的缓冲液进行缓冲液交换，以消除对蛋白质测定的干扰。

2. PDE6酶活性测定

a. 使用无机磷酸盐的比色测定法量化 cGMP 水解的速率，其中通过 PDE6 将 cGMP 分解为 5'-GMP，然后添加 5'-核苷酸酶以释放无机磷酸盐（Cote，2000）。

b. 为了测量样品中存在的 PDE6 的总量，将酶与胰蛋白酶一起孵育以蛋白水解消化与全酶紧密结合的抑制性 γ-亚基（Pentia等人，2005）。计算样品中 PDE6 的量，知道胰蛋白酶激活的 PDE6 的催化转换数 [kcat = 5600 cGMP 水解/s per PDE6 (Mou et al ., 1999) ]。

c. 为了计算加入 Gtα 诱导的最大激活百分比（参见图 4），转导素对脂珠上 PDE6 催化活性的激活程度参考最大胰蛋白酶激活酶活性（步骤 G2b）。

d. 在没有添加 Gtα* 的情况下测量脂珠上的 PDE6 基础（即非活化）活性。

数据分析

A. 评估 Gtα* 激活 PDE6 催化的能力。

1. 文献中有大量证据（Malinski 和 Wensel，1992 年；Melia等人，2000 年）支持膜附着对于 Gtα* 有效激活 PDE6 的重要性。 G 蛋白及其效应子的膜结合降低了扩散接触的维度，并且还产生了这些相互作用蛋白的高局部浓度。

2. 图4表明，溶液中 PDE6 的 Gtα* 活化（蓝色符号）远不如在检测 PDE6 活化之前将相同浓度的 PDE6 和 Gtα* 与脂珠预孵育（黑色符号）有效。图 4 还显示，随着与脂珠结合的 PDE6 浓度增加（比较黑色和红色符号），Gtα* 可以激活 PDE6 的功效大大增强。在这些条件下，与脂珠结合的 PDE6 增加 10 倍，使 PDE6 激活 50% 所需的 Gtα* 浓度降低 5 倍。

图 4. PDE6 的 G 蛋白活化在脂珠上以浓度依赖性方式增强。

在室温下，将 PDE6 全酶（0.2 nM 或 2 nM）与 1.1 pmol 脂珠一起孵育 30 分钟，然后加入指定量的 Gtα-GTPγS（Gtα*）45 分钟。在没有脂珠的情况下，将单独的 PDE6 样品与 Gtα* 混合。添加 cGMP（2 mM 终浓度）后，通过监测 cGMP 的降解来确定 PDE6 被 Gtα* 激活的程度。 Gtα* 的激活程度表示为当 PDE6 的抑制性 Pγ 亚基通过有限的胰蛋白酶蛋白酶解去除时测量的 PDE6 活性百分比。数据代表 3 次实验的平均值 ± SD（蓝色和黑色符号；三个没有误差线的黑色符号是单独测定）或 2 次实验的平均值和范围（红色符号）。

B. 使用化学交联表征蛋白质复合物的形成。

1. 蛋白质复合物的形成取决于化学交联后 SDS-PAGE 上较高分子量条带的出现（图 2）。

2. 通过从凝胶中切除考马斯染色条带、用胰蛋白酶进行消化并通过质谱分析来确定存在于各种交联复合物中的蛋白质的身份（图 2）（详见Irwin等人，2019 年）。

3. 交联肽的鉴定能够对脂珠上的 Gtα*-PDE6 复合物进行综合结构建模，如Irwin等人中详细描述的。（2019）。

笔记

脂珠特性：

1. 单个 100 nm 单层脂质体包裹二氧化硅颗粒（表面积 = 0.031 μm ²）计算为每个颗粒包含 80,047 个磷脂 [使用 Encapsula NanoSciences 计算器 ( https://encapsula.com/calculator )]。

该计算基于对磷脂头基面积的了解 [对于磷脂酰胆碱，0.71 nm ² (Kucerka et al ., 2006) ] 和脂质双层的厚度[ 5 nm (Marquardt et al ., 2016) ]。

2. 单层膜中磷脂的分布计算为外单层中的55％和内单层中的45％，这与通过挤出制备的100nm单层脂质体的^{31 P NMR光谱一致}(Malinski和Wensel，1992) 。

3. 包裹二氧化硅颗粒的总磷脂浓度：46 nM 颗粒× 80,047 个脂质/颗粒 = 3.7 mM；因此，在最初制备脂珠时存在 2.7 倍过量的磷脂。

4. 表面可接近（即外单层）磷脂浓度 = 2.0 mM。

5. 已发现脂质珠制剂的稳定性（通过 Gtα* 激活 PDE6 的程度以及 PDE6 与脂质珠结合的程度来判断）在脂质珠的初始制备和室温储存三天后显着下降。

食谱

1. HNM 缓冲液（1 升）

20 mM HEPES-0.5Na (4.986 g)

100 毫米氯化钠（5.844 克）

2 mM MgCl ₂· 6H ₂O (0.407 g)

酸碱度 7.5

2. PDE6 存储缓冲液（1 升）

20 mM HEPES-0.5Na (4.986 g)

100 毫米氯化钠（5.844 克）

2 mM MgCl ₂· 6H ₂O (0.407 g)

2 毫米 DTT（0.308 克）

50% (v/v) 甘油

3. Gtα存储缓冲液 (1 L)

10 mM Tris 碱 (1.211 g)，pH 7.4

2 mM MgCl ₂· 6H ₂O (0.407 g)

2 毫米 DTT（0.308 克）

°C储存前立即添加 50 μM GDP [50 mM GDP 和 40% 甘油 (v/v) 的 1/1,000 稀释度] 。

4. 745 µM AlCl ₃在 HNM 缓冲液中

100 mL HNM 缓冲液中的AlCl _{3 (9.9 mg)}

5. HNM 缓冲液中的 250 mM NaF

10 mL HNM 缓冲液中的 NaF（105 mg）

6. 1 M氯化镁₂

MgCl ₂· 6H ₂O (2.033 g) 在 10 mL 水中

7. 50 毫米国内生产总值 (1 毫升)

GDP-Na (23.3 mg) 溶于 10 mM Tris，pH 7.5

8. 10 毫米 BS3 (175 微升)

在 175 μL 水中加入 1 mg BS3

9. 0.5 毫米 BS3 (20 微升)

1 μL 10 mM BS3 用 HNM 缓冲液稀释至 20 μL

致谢

这项工作得到了国家眼科研究所赠款 R01 EY05798 和国家普通医学科学研究所赠款 P20 GM113131 的支持。该协议的缩写版本首次出现在 Irwin等人。（2019 年；doi：10.1074/jbc.RA119.011002）。

利益争夺

作者声明没有竞争的财务或非财务利益。

参考

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