材料和试剂

1. 24孔平底聚苯乙烯板（Corning，Costar，目录号：CLS3524）

2. 48孔平底聚苯乙烯板（Corning，Costar，目录号：CLS3548）

3. 1.5毫升Eppendorf 管

4. 50毫升猎鹰管

5. 0.22 µm 滤光片

6. 75 cm ²组织培养瓶（TPP，目录号：TPP 90075）

7. 5 mL圆底管，带卡扣（Corning，Costar，目录号：352058）

8. 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（Lonza，目录号：LZ-CC-2517），将冷冻保存的细胞储存在 -80 °C

9. EGM 内皮生长培养基子弹套件（Lo nza，目录号：LZ-CC-3124），一旦准备好，在 6 周内使用补充的 EGM。在 4 °C 下储存，每次使用前，在 37 °C下仅加热所需的培养基量。

10. Accutase（Gibco，目录号：A110501）。储存在 4 °C 并在使用前在 37 °C 下预热。

11. 9 mL血液。处理新鲜的并将分离的 PMBC 储存在 4°C 直至使用。

12. 淋巴制备（STEMCELL，目录号：07851）。 4°C 保存，使用前避光室温平衡。

13. rhTNF（Peprotech，目录号：300-01A）。储存在 -20 °C，避免多次解冻/冷冻循环。

14. 蒸馏水*

*注：此项目可以从任何有资格的公司订购。

15. 氯化钾（KCl）（Merck，目录号：104936）

16. 磷酸二氢钾（KH ₂PO ₄）（Acros Organics，目录号： ACRO271080025）

17. 磷酸二氢钠（NaH ₂PO ₄）（VWR Chemicals，目录号：28013.264）

18. 氯化钠（NaCl ）（Merck，目录号：S9625-500G）

19. 氢氧化钠（NaOH）（Merck，目录号：43617-1L）

20. RBC 裂解缓冲液（Invitrogen，目录号：00-4333-57）。存储在 RT。

21. BSA – 用于 FACS 缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）。在 4°C 下储存冻干原液。

22. BSA – 用于分选缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：126609）。在 4°C 下储存冻干原液。

23. 叠氮化钠纯（NaN ₃）（AppliChem，目录号：A1430）。在 4°C 下储存冻干原液。

24. UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0（Invitrogen，目录号：15575-020）。储存于 4°C。

25. 流式细胞仪抗体（所有抗体在 4°C 避光保存）：

a. FITC 抗人 CD31（Biolegend，目录号：303104 – 1:100）

b. PE抗人CD56（Biolegend，目录号：362508 - 1：100）

c. PE-Cy5 抗人 CD106（Biolegend，目录号：305808 – 1:100）

d. Pacific Blue 抗人 CD54（Biolegend，目录号：353110 – 1:100）

e. APC 抗人 CD3（BC，目录号：IM2467– 1:100）

f. PE-Cy7 抗人 CD4（BC，目录号：737660 – 1:400）

g. PE-CF594 抗人 CD14（BD，目录号：562335 – 1:400）

h. Alexa Fluor 700 抗人 CD8（Biolegend，目录号：344724 – 1:100）

i. APC-H7 抗人 CD19（BD，目录号：641395 – 1:100）

26. CountBright Absolute Counting Beads（Thermo Fisher，目录号：C36950）。 4°C避光保存

27. 1 ×磷酸盐缓冲液 (PBS)（内部，参见配方）。存储在 RT

28. 液（见配方）。储存于 4°C

29. 排序缓冲区（参见配方s ）。储存于 4°C

设备

1. 水浴*

2. 离心机*

3. BD FACSAria II (BD Biosciences) – 或任何其他配备蓝色激光的荧光激活细胞分选仪

4. BD LSRFortessa (BD Biosciences) – 或任何其他配备必要激光器的流式细胞仪

5. 细胞培养箱* (5% CO ₂, 37°C)

6. 高压灭菌器*

*注意：这些物品可以从任何合格的公司订购。

软件

1. BD FACSDiva ^TM（BD 生物科学，v8.0.2， https://www.bdbiosciences.com ）

2. FlowJo (Treestar, v10.8.0, https://www.flowjo.com/ )

3. 棱镜（GraphPad v9.2.0， https: //www.graphpad.com/ ）

程序

A. 欧共体文化

1. 在 37°C 的水浴中解冻冷冻保存的 EC，并将细胞转移到含有 10 mL完整 EGM的 Falcon 管中。然后，将细胞悬液直接转移到 75 cm ²烧瓶中，置于 37°C 培养箱中。

2. 一旦细胞粘附在烧瓶上（约 4 小时至 6 小时后），丢弃培养基以去除 DMSO 的痕迹，并添加 10 mL的新鲜培养基。

3. 每 2-3 天更换一次培养基，一旦汇合，用 1 mL Accutase 在 37°C 下分离 EC 5 分钟。

4. 添加 10 mL的完整 EGM，收集细胞悬浮液，并将其转移到 Falcon 管中。 200 ×离心机 g在室温下 5 分钟。

5. 丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在 1-2 mL的完整 EGM 中。计数并重新镀上 EC。

注意：对于“更快”的传代，种子 8'000-10'000 个细胞/cm ²。

6. 仅在第 4 和第 6 段之间使用 Ecs 进行功能分析。

7. 在 500 个 24 孔板（约 100,000 个细胞/孔）中以 80% 融合的板 Ecs µl 完整的 EGM。

B. EC 预处理

1. 一旦细胞贴壁，取出培养基，用 1 mL的 PBS 1 ×洗涤 EC 。

2. 在以下培养条件下孵育 EC：

a. 阴性对照：仅500 μL的完整 EGM 。

b. 阳性对照：500 μL的完整 EGM，含有20 ng/ mL的 TNF。

注意：众所周知，TNF 是一种细胞因子，可以在体外强烈上调 E-Selectin、ICAM-1 和 VCAM-1 粘附分子在 ECs 上的表达，因此代表了强大的阳性对照。

c. 实验设置： 500 µL包含 ILCP的完整 EGM，比例为 1:1。

注意：该协议可以适应任何感兴趣的免疫细胞类型，并且可以调整比率。请参阅 Vanoni 等人。 (2021) 了解有关 ILCP 隔离和培养的更多详细信息。

3. 在 37°C 下孵育Ecs 3 小时。

4. 3 h 后，弃去上清液，用 PBS 1 ×进行两次洗涤。

5. 通过添加 150 μL的 Accutase分离EC，并在 37 °C下孵育5 分钟。

6. 添加 1 mL的完整 EGM。将细胞悬液转移到 5 mL圆底管中，用 3 mL PBS 1 ×洗涤。

7. 以 200 ×离心细胞 G 在室温下5 分钟。

C. EC分拣

注意：如果您在进行静态粘附测定之前未将 EC 与其他细胞类型一起孵育，则不需要此部分。从步骤B7，您可以直接进入步骤D1。

1. µl分选缓冲液中的 FITC 抗人 CD31 抗体染色 EC 。在黑暗中在 RT 中孵育 20 分钟。

2. mL PBS 1 ×洗涤细胞，200 ×离心 g在室温下 5 分钟。

3. 根据制造商的说明并遵循下面显示的门控策略（图 1），将细胞重新悬浮在 500 μL 的分拣缓冲区中并继续分拣。在含有 500 µl完整 EGM的 1.5 mL Eppendorf 管中收集细胞。

4. 200 ×离心细胞 g 5 分钟，然后在 250 μL 的完整 EGM 中将它们重新镀在 48 孔平底板中。在 37°C 下放置过夜，或等到细胞贴壁。

图 1. 丰富 CD31 ⁺ECs 的门控策略。

在与 ILCP 孵育 3 小时后，必须对 CD31 ⁺EC 进行分类，以便在不污染 CD31 ^-ILCP 的情况下进行静态粘附测定。如图 B 中的 SSC-A 与 FITC-A 点图所示，ILCP在体外共培养过程中粘附在 EC 上。为了使 ECs 经历相同的步骤，还必须对未处理 (CTRL) 或 TNF 处理的 ECs（未显示）进行分类（未刺激和 TNF 刺激的 ECs 的示例分别显示在图 2A 和 2B 中）。

D. 从新鲜血液中分离 PBMC

1. 同时，在 50 mL Falcon 管中，分配 12 mL的 1.077 g/ mL Ficoll-Hypaque。

2. 在另一个 50 mL Falcon 管中，转移 9 mL血液，并加入 9 mL PBS 1 × 。

3. 将 18 mL的 PBS 稀释新鲜血液轻轻转移到 Ficoll-Hypaque 溶液上，小心不要混合它们。

4. 650 ×离心机 g在 RT 下 20 分钟内，无制动（加速/减速率为 9/0）。

5. 收获 PBMC 层，并将其转移到新的 50 mL Falcon 管中。

6. 用 PBS 1 ×清洗 PBMC，最多填充 50 mL 。

7. 450 ×离心机 g在 RT 下 5 分钟，带刹车 (9/9)。

8. 去除上清液，并进行第二次洗涤，最多填充 40 mL 。

9. 200 ×离心机 g在 RT 下 10 分钟内，无制动 (9/0)。

注意：此步骤将允许血小板去除。

10. 去除上清液，用 500 µL RBC 裂解缓冲液在 37°C 下孵育细胞沉淀 5 分钟。

11. 用 PBS 1 ×清洗 PBMC，最多填充 50 mL 。

12. 450 ×离心机 g在 RT 下 5 分钟，带刹车 (9/9)。

13. 在培养基中重悬细胞并进行细胞计数。

E. 静态粘附试验

：在 Safuan 等人的原始协议中。 (2021)，静态粘附试验持续 5 分钟。通过进行动力学实验，我们观察到 30 分钟是最佳的潜伏期，它允许发生特定的粘附事件。

1. EC 粘附后的第二天/一旦，弃去上清液并用 500 µl PBS 1 ×洗涤细胞。

2. 以 1:4 的比例 (EC:PBMC) 将新鲜分离的 PBMC 添加到每个孔中，在 37°C 下 3 0 分钟，最终体积为 200 μL的完整EGM。

3. 30 分钟后，弃去孔中的上清液。

4. μL的 PBS 1 ×执行两个洗涤步骤，以确保从 EC 单层中去除非粘附细胞。

5. 在 37°C 下将 EC 与 200 µL Accutase一起孵育 5 分钟，将 EC 与粘附的 PBMC 分离。

6. 添加 1 mL的完整 EGM。将细胞悬液转移到 5 mL圆底管中，用 3 mL PBS 1 ×洗涤。

7. 以 200 ×离心细胞 g在室温下 5 分钟。

8. 使用 50 μL的 FACS 缓冲液对细胞进行染色，在黑暗中在 RT 处染色 20 分钟，并按照材料和试剂 - 流式细胞术抗体部分中列出的稀释抗体。

9. 同时，让 CountBright Absolute Counting Beads 在 RT 平衡。

10. mL的 PBS 1 ×洗涤细胞并在 450 ×离心 g在 RT 下 5 分钟，带刹车 (9/9)。

11. μL的 FACS 缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。

12. 设置流式细胞仪后，在采集样品之前，将 20 µL涡旋良好的 (30”) CountBright Absolute Counting Beads 添加到样品中。

13. 在 2000 个记录事件处设置停止门“珠子”。

数据分析

1. 获取所有样本后，使用 FlowJo 打开您的“.fcs”文件。

2. 检查补偿矩阵后，在 EC 和 PBMC 周围画一个门，并根据图 2 所示的门控策略可视化不同的 PBMC 子集。

3. 分析完成后，将结果（特别是显示每个门控群体中包含的绝对细胞数的列）导出到 excel 文件，并复制粘贴粘附的 CD4 ⁺和 CD8 ⁺T 细胞的数量，CD14 ⁺单核细胞、CD19 ⁺B 细胞和 CD56^暗/亮泛 NK 细胞到 Prism 表，用于数据可视化。

4. 重复实验至少两次（2 ×阳性和阴性对照 - 技术复制，并使用两个不同的 PB 健康供体 - 生物复制）。

5. 运行配对t检验统计显着性（棱镜）。

图 2. 静态粘附试验结果分析。

使用 FlowJo 并根据使用的抗体，可以可视化和提取在静态条件下体外粘附到 ECs 上的 T 细胞、B 细胞、单核细胞和 NK 细胞的绝对数量。正如预期的那样，与 TNF 处理的 ECs (B) 相比，未处理的 ECs (A) 导致更少的 PBMCs 粘附，从而分别定义了良好的阳性和阴性对照。由于该测定允许 EC 的恢复，因此可以研究，例如，不同刺激 (C) 下的粘附分子表达。

笔记

该协议可以适应其他细胞类型而不是 ILCP，以评估不同免疫细胞群/可溶性分子/药物在体外影响 EC 粘附特性的能力。

食谱

1. 1 × PBS（通过 0.22 µm 过滤器过滤）

蒸馏水

氯化钠

氯化钾

Na ₂HPO ₄

KH ₂PO ₄

氢氧化钠

在 800 mL 蒸馏水中溶解以下数量的盐：

8 克氯化钠

0.2 克氯化钾

1.44 克 Na ₂HPO ₄

0.24 克 KH ₂PO ₄

用 NaOH 调节 pH 至 7.4，过滤并在 121°C 高压灭菌 20 分钟。

用额外的蒸馏水将体积调整到 1 L。

2. FACS 缓冲液 – 仅用于染色

PBS 1 ×

乙二胺四乙酸 5mM

BSA 0.2%

叠氮化钠 0.2%

要准备用于流式细胞仪采集的缓冲液，请添加到 1 L 的 PBS 1 ×中：

10 毫升 EDTA 0.5 M

2 克 BSA

2克叠氮化钠

3. 排序缓冲液（通过 0.22 µm 过滤器过滤）

PBS 1 ×

EDTA 5 毫米

BSA 0.2%

要准备用于排序的缓冲区，请添加到 1 L 的 PBS 1 ×中：

10 毫升 EDTA 0.5 M

2 克 BSA

致谢

这项工作得到了瑞士国家科学基金会 (PRIMA PR00P3_179727) 对 CJ 的资助；瑞士癌症联盟 (KFS-4402-02-2018) 转 CJ；从洛桑大学的女性专业交易所到 ST。这项工作最初作为研究文章发表在 eLife (DOI:10.7554/eLife.58838) 杂志上。

利益争夺

作者代表原始作品的所有作者声明没有竞争的财务或非财务利益。

伦理

在洛桑大学医院研究所审查委员会的批准下，静脉血是在瑞士洛桑当地输血中心从健康献血者身上抽取的。所有受试者均根据赫尔辛基宣言给予书面知情同意。

参考

1. Muller, WA 和 Luscinskas, FW (2008)。体外跨内皮迁移的测定。 方法 Enzymol 443：155-176。

2. Safuan, S., Storr, SJ, Patel, PM 和 Martin, SG (2012)。黑色素瘤和乳腺癌细胞与血液和淋巴内皮粘附的比较研究。 淋巴水库生物学10（4）：173-181。

3. Schimmel, L.、Heemskerk, N. 和 van Buul, JD (2017)。白细胞跨内皮迁移：局部事件。 小 GTP 酶8(1)：1-15。

4. Vanoni, G., Ercolano, G., Candiani, S., Rutigliani, M., Lanata, M., Derre, L., Marcenaro, E., Schneider, P., Romero, P., Jandus, C. et人_ （2021 年）。人类引发的 ILCP 通过 NF-κB 信号传导支持内皮激活。生命10 ：e58838 。