材料和试剂

1. 1.5 ml 微量离心管（Fisher，目录号：05-408-129）

2. 移液器和吸头（Eppendorf，目录号：2231300002）

3. Drummond 校准的微量移液器（100 µl）（Drummond Scientific Company，目录号：2-000-100）

4. PCR管（Fisher，目录号：14-230-225）

5. 50 ml 离心管（Corning，目录号：430829）

6. 细胞培养管（Fisher Scientific，目录号：14-959-1B）

7. 血清移液管（Midsci，目录号：TP94010、TP94005）

8. 各种尺寸的带挡板细胞培养瓶（Thermo Scientific，目录号：41100250、41100250 ）

9. 10 ml注射器（Becton Dickinson（BD），目录号：302995）

10. 大肠杆菌OverExpress C43（DE3）感受态细胞（Lucigen，目录号：60442-1）

11. pQE82L 表达载体

12. 液氮

13. Luria Broth Media （RPI Research Products，目录号：L24400 ）

14. 氨苄西林钠盐（Sigma Aldrich，目录号：A0166）

15. 头孢氨苄水合物（Alfa Aesar，目录号：J63672-06）

16. 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（Gold Bio，目录号：I2481C）

17. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）

18. Tris 碱（Sigma-Aldrich，目录号：1070897600）

19. Ready-Lyse 溶菌酶溶液（Lucigen，目录号：R1804M）

20. OmniCleave 核酸内切酶（Lucigen，目录号：OC7850K）

21. 乙二胺四乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）

22. 氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）

23. 氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：529552）

24. 氯化钙（Sigma-Aldrich，目录号：C8106）

25. 氢氧化钾（Sigma-Aldrich，目录号：221473）

26. 盐酸（Acros Organics，目录号：AC450550025）

27. LB培养基（见配方）

28. 停止缓冲液（见食谱）

29. 移液器溶液（细胞内溶液）（见配方）

30. 沐浴液（见配方）

设备

1. -80°C 冰箱

2. 水浴

3. 温控培养摇床（New Bruinswick Scientific，C25KC 型经典系列培养摇床）

4. 分光光度计/Nanodrop

5. 高压釜

6. 离心机（Eppendorf，型号：5810R）

7. 去离子水（18.2 µΩ 电阻）

8. pH计（Thermo Scientific Orion Star A214）

9. 电生理设置：

空气表 (TMC)

荧光显微镜（奥林巴斯，型号：IX70）

显微操作器（Scientifica，型号：ACCi UI）

Digidata 1440A（Axon 仪器）

Multiclamp (Axon Instruments)

灌注系统（自制重力灌注系统）

Chamber（Warner Instruments，目录号：RC26）

10. 细菌生长培养箱

11. 移液器拉拔器（Sutter Instruments，型号：P-97）

12. 相差显微镜（Invitrogen，型号：EVOS M5000）

软件

1. pCLAMP 和 Clampfit（分子装置）

程序

A. 制作原生质球

1. 细菌转化

a. 从 -80°C 冰箱中取出一份 (40 µl)大肠杆菌OverExpress C43 (DE3) 感受态细胞，置于冰上约 5 分钟使其解冻。

b. 然后，添加 1 ng 含有感兴趣基因的质粒。我们将含有 MthK-IR（灭活去除钙激活钾通道）基因的 pQE82L 表达载体用于细菌，并轻轻轻弹试管使它们充分混合。让它在冰上孵育约 30 分钟。

c. 孵育后，将 DNA 感受态细胞混合物置于 42°C 水浴中进行热休克 45 秒，然后将管放回冰上 5 分钟，然后将其铺在含有适当抗生素（氨苄青霉素）的 LB 琼脂平板上在这种情况下）。

d. 将板在 37°C 下孵育过夜。

2. 细菌生长

a. 第二天（转化后 16 小时），从板上挑取一个菌落，将其接种到 20 ml LB 培养基中，并在 60 ml 细胞培养瓶中保存抗生素。

b. 在 37°C 和 220 rpm 的振荡器中孵育培养物。3 小时后，使用分光光度计或 nanodrop 定期（每 20-30 分钟）检查培养物的光密度 (OD ₆₀₀)，直到 OD ₆₀₀达到 ~0.7。

3. 头孢氨苄治疗

a. 在 42°C 下预热 55 ml 经高压灭菌的 LB 培养基。一旦培养物达到 OD ₆₀₀= 0.7，将培养物放在冰上，快速取出 5 ml 这种液体培养物，并添加到 55 ml 含有抗生素的预热 LB 培养基中。添加 50 μg/ml 头孢氨苄。

b. 将培养物放入 42°C 的培养箱中，并将摇床的速度降低至 120 rpm（“蛇形”大肠杆菌细丝非常脆弱）。

c. 每 20 分钟取出 100 μl 培养物，并在显微镜下观察以检查头孢氨苄处理的效率（图 1A）。

d. 根据我们的经验，这个过程通常需要大约 2 小时。一旦蛇状细丝长于 100 µm，将培养物置于室温下。将振荡器的温度降至 37°C（通常需要大约 15 分钟）。

e. 向培养物中加入 0.8 mM IPTG，然后将其放回 37°C 和 120 rpm 的培养箱中再培养一小时。

4. 原生质球制备

a. 诱导后，将 60 ml 细胞培养物等体积分入三个 50 ml 离心管中。将培养物在4°C 下以453 × g低速离心15 分钟。小心丢弃上清液，因为细菌不会牢固地附着在管子底部。将三个装有细菌沉淀的管子放在冰上，轻轻地将每个沉淀重悬在 3 ml 的 1 M 蔗糖中。

b. 将 240 μl 1 M Tris、pH 8.0、67,500 单位 Ready-Lyse 溶菌酶溶液 (Lucigen)、1,600 单位 OmniCleave 核酸内切酶 (Lucigen) 和 20 μl 500 mM EDTA 添加到重悬细胞中并在室温下孵育。孵育 10 分钟后，将 1 ml停止缓冲液（参见配方）添加到三个管中的一个，并通过轻轻旋转管混合。将管子放在冰上。同样，分别在孵育 20 分钟和 40 分钟后将停止溶液添加到其他两个管中，并通过轻轻旋转管混合。添加停止缓冲液后，立即将所有管子放在冰上。从每个原生质球制剂中取出 20 μl 溶液，并在显微镜下检查以确定三种最佳原生质球制剂，如图 1B 所示。

c. 在相差显微镜下, 精心准备的原生质球看起来像深灰色圆圈 (图 1C)。选择具有最高数量的深灰色原生质球的制剂。将原生质球分装到 PCR 管中（50μl 每管），在液氮中快速冷冻，并在 -80°C 下储存直至进一步使用。如果储存在 -80°C，原生质球可用于记录 6 个月。

图 1. 原生质球制备示意图。

A.头孢氨苄处理前大肠杆菌细胞培养物的图像。比例尺等于 50 µm。B. 相差显微镜下 50 μg/ml 头孢氨苄处理 2 小时后“蛇样”细菌丝的图示。比例尺为 100 µm。C. 显示用溶菌酶和 EDTA消化大肠杆菌外膜后的原生质球的相差图像。深灰色圆圈（红色箭头）是一种很好的原生质球，可以形成千兆欧姆密封，而透明圆圈（蓝色箭头）不适合修补。比例尺表示 50 µm。

B. 贴片夹紧原生质球

a. 解决方案：与 HEK293 或X. Laevis卵母细胞等细胞系相比，细菌具有更高的细胞质渗透压。在我们的实验中，我们记录了来自 Mthk 的电流，它是一种钙激活的钾通道，因此移液管溶液（细胞内溶液）（参见食谱）和浴液（参见食谱）具有不同的钙浓度。不同浓度钙的渗透压应相应地用蔗糖调整。

b. 玻璃电极：我们选择了 100 µl Drummond 校准的微量移液器。微量移液器由 N51A 硼硅玻璃制成，内径为 1.3 毫米，外径为 1.68 毫米。用电极拉拔器（Sutter Instruments Model P97）拉动移液器，使气泡数（如下所述）在 5.0-5.5 之间。

c. 由于大肠杆菌原生质球的尺寸相当小 (5-10 µm)，因此玻璃电极的尖端尺寸需要约为 1 µm，这太小了，无法在光学显微镜下进行准确评估。因此，为了校准玻璃电极的尖端尺寸，这对于修补原生质球的成功率非常重要，应该使用“气泡数”作为标准（Mittman等，1987）。拉动玻璃电极并将其连接到带有吸气器的 10 毫升注射器，以形成气密密封，如图 2A 所示。将微量移液器浸入甲醇中至约 1 厘米深，然后从 10 毫升刻度处缓慢按下柱塞，直到甲醇中出现细小的气泡流（图 2B、2C）。此时读出的体积是微量移液器的“气泡数”（或注射器中剩余的空气量是气泡数），理想情况下该数字应介于 5.0 到 5.5 之间。根据我们的经验，5.5 到 6 之间的“气泡数”也是可用的（参见视频 1）。如果气泡数在此范围之外，则应相应修改电极拉拔程序，直到尖端尺寸落在此范围内。

图 2. 气泡数测量。

A. 与抽吸器相连的 10 毫升注射器的图示。B. 将微量移液器的尖端浸入装有甲醇的小瓶中，柱塞设置为 10 毫升。C. 在柱塞上施加正压。观察甲醇中首次出现的气泡。注射器上的相应读数是气泡数。气泡数介于 5.0 和 5.5 之间的移液器是修补原生质球的理想选择。

视频 1.气泡数测量。

d. 原生质球修补

注意：保持玻璃尖端清洁以形成千兆欧姆密封非常重要，因此在将电极浸入浴液之前应施加正气压。

原生质球不会粘在腔室玻璃表面的底部。如果施加的正压太大，则原生质球被推开。要克服这个问题，请使用非常低的正压（5 到 10 毫巴的压力就足够了）。或者，在接近原生质球之前释放压力。另一个相关的问题是，很难看到玻璃电极尖端的正压造成的原生质球上的凹痕；虽然我们对此没有解决方案，但通过一些实践，研究人员可以了解何时施加负压以与电极形成千兆欧姆密封。

C. 寻找好的原生质球

当用相差显微镜成像时，一小部分原生质球似乎已经失去了它们的内部相差。根据我们的经验，这些类型的原生质球无法与玻璃电极形成千兆欧姆密封。

形成由内而外的贴片：一旦形成千兆欧姆密封，将玻璃微电极从腔室底部移开（注意：不要将其从浴液中移出）。通过轻弹它在头部舞台上应用一个尖锐但温和的运动。这将在微电极尖端和原生质球之间施加巨大的剪切力。有时这一步会导致千兆欧姆密封的丢失。

食谱

1. LB培养基

25克颗粒状LB

1 L ddH ₂O

2. 停止缓冲区

0.8 M 蔗糖

80 mM Tris，pH 8.0

12 mM 氯化镁₂

3. 移液器溶液（细胞内溶液）

150 毫米氯化钾

20 mM 氯化镁₂

15 mM Tris，pH 8.0

0.1 毫米氯化钙₂

450 mM 蔗糖

4. 浴液

150 毫米氯化钾

20 mM 氯化镁₂

15 mM Tris，pH 8.0

致谢

我们要感谢 VA Klenchin 博士在该协议的各个方面提供的帮助。我们要感谢马里兰大学的 Sergei Sukharev 博士在膜片钳细菌原生质球方面的帮助。我们感谢美国国立卫生研究院（NS-116850、NS-101723、NS-081293、GM131662）、麦克唐纳神经科学中心、CIMED 和麻醉学系的研究支持。该协议源自原始研究论文“古细菌离子通道 MthK 的激活受到温度的精确调节”（Jiang et al. , 2020）。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

1. Cordero-Morales, JF, Jogini, V., Chakrapani, S. 和 Perozo, E. (2011)。KcsA C 型失活的多点氢键网络。生物物理学杂志100(10): 2387-2393。

2. Cuello, LG, Jogini, V., Cortes, DM 和 Perozo, E. (2010)。K ⁺通道中C型失活的结构机制。自然466（7303）：203-208。

3. Doyle, DA, Morais Cabral, J., Pfuetzner, RA, Kuo, A., Gulbis, JM, Cohen, SL, Chait, BT 和 MacKinnon, R. (1998)。钾通道的结构：K ⁺传导和选择性的分子基础。科学280（5360）：69-77。

4. Fan, C.、Sukomon, N.、Flood, E.、Rheinberger, J.、Allen, TW 和 Nimigean, CM（2020 年）。钙门控钾通道中的球链失活。自然580(7802)：288-293。

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