材料和试剂

1. Superfrost显微镜载玻片（Superfrost Plus；ThermoScientic，Menzel-Gläser，目录号：J1800AMNZ），室温储存

2. 方形盖玻片（盖玻片 22 × 50 毫米；ThermoScientic，Menzel-Gläser，目录号：MA062210），室温储存

3. 24 孔细胞培养板（TPP，目录号：92024），室温储存

4. 15 ml Falcon 管（Greiner，188271 Zentrifugenröhrchen 15 ml，生产商：Huberlab AG，7.188 271），室温保存

5. 正常熔点琼脂糖（Standard Agarose-Type LE；BioConcept，目录号：7-01P02-R），室温储存

6. 低熔点琼脂糖（Low Melt Agarose 100 g；Bio & Sell，目录号：BS20.47.100），室温储存

7. 胰蛋白酶 10× 储备液（Gibco，目录号：15090-046），在 -20°C 下储存储备液。工作液用 1×PBS 1:10 稀释，4°C 下可稳定数周。

8. 氯化钾（KCl）（默克，目录号：1.04936.1000），在室温下储存

9. Na ₂HPO ₄·7H ₂O（Sigma-Aldrich，目录号：S9390-1Kg），室温储存

10. KH ₂PO ₄（Sigma，目录号：602187），室温储存

11. NaCl（Sigma，目录号：71380-1KG），室温储存

12. EDTA二钠盐二水合物（C ₁₀H ₁₄N ₂Na ₂O ₈·2H ₂O）（Sigma-Aldrich，目录号：03685-1KG），室温储存

13. Tris 碱（Sigma，Life science，目录号：T1503-500G），室温储存

14. 氢氧化钠颗粒（NaOH）（默克，目录号：1.06498.100），室温储存

15. DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D5879-1L），室温储存

16. Triton X-100（MP-Biomedicals，目录号：807426），室温储存

17. SYBR Gold 核酸凝胶染色剂（Life Technologies，目录号：S11494），等分并避光储存于 -20°C

18. N-月桂酰肌氨酸（Sigma，目录号：L5125），室温储存

19. 乙酸钠（C ₂H ₃NaO ₂）（Fluka，Biochemika，目录号：71183），室温储存

20. 裂解缓冲液（见配方）

21. 电泳缓冲液（见配方）

22. 彗星染色溶液（见配方）

23. PBS（磷酸盐缓冲盐水）（见配方）

设备

1. Trevigen CometAssay ESII装置（Trevigen，目录号：4250-050-ES）

2. 能够在 470 和 530 nm 之间激发以成像 SYBR-Gold 的荧光显微镜（最大激发大约 495 nm，发射大约 537 nm）

3. 水浴能够保持 37°C 的恒定温度并且足够容纳 250 毫升玻璃瓶

4. 大的泡沫聚苯乙烯盒或类似物，大到足以容纳 10-12 个冰上彗星滑梯的玻璃板

5. 小机械师等级

6. Coplin 罐可容纳 5 或 10 个载玻片

7. Faxitron 机柜 X 射线系统，RX-650 型 (faxitron.com)

软件

1. 斐济图像处理包（https://imagej.net/Fiji）

2. 斐济的 OpenComet 插件 ( http://www.cometbio.org/ ) (Gyori et al ., 2014)

程序

A. 琼脂糖涂层载玻片的制备（测定前一天或更早）

1. 通过在微波炉中的玻璃瓶中加热，将 1 g 正常熔点琼脂糖完全溶解在 100 ml dH ₂O （1% 溶液）中。务必将盖子松散地盖在瓶子上，并注意防止沸腾。

2. 吸取 1 ml 琼脂糖溶液到超冻载玻片上，盖上盖玻片使其均匀分布在载玻片上，让琼脂糖在室温下凝固。琼脂糖涂层的厚度约为 1 毫米，与盖玻片重叠有助于将琼脂糖均匀分布在载玻片上并确保表面平整。

3. 当琼脂糖凝固后，轻轻地将盖玻片滑向载玻片的短端，然后将载玻片风干过夜。

4. 当载玻片完全干燥后，它们可以直接使用或在干燥、凉爽的空间中存放数月。

注意：用正常熔点的琼脂糖预涂载玻片会增加含有用于彗星分析的细胞的琼脂糖层的粘附力。

B. 培养感兴趣的细胞

确保您感兴趣的细胞在培养中并呈指数增长（即，在检测时大约在 60% 到 80% 之间汇合）。根据您在所选培养基中建立的细胞培养程序，在运行检测前 1-3 天拆分您感兴趣的细胞。

注意：这里描述的彗星试验可用于确定各种培养细胞中的 DNA 损伤，前提是它们可以被带入单细胞溶液中。由于特定设置引起的 DNA 损伤量和修复动力学将取决于所使用的细胞系，因此需要通过实验确定理想的治疗和修复设置。

C. 在检测当天准备材料

1. 准备适量的中性彗星裂解缓冲液并冷却至 4°C。确保有足够的冷 dH ₂O 来新鲜制备冷电泳缓冲液。所需的裂解缓冲液量取决于将使用的科普林罐的体积和数量。通常，一个中等大小的科普林罐可以容纳 10 张载玻片，并且需要大约 150 毫升的缓冲液。所需的电泳缓冲液量取决于所使用的设备。对于此处使用的 CometAssay ESII 装置，计算大约 850 ml。此数量不取决于幻灯片的数量，因为幻灯片的空白空间将被虚拟幻灯片填满。

2. 将彗星电泳仪（包括冷却包）置于 4°C 进行冷却。

3. 将水浴加热至 37°C。

4. 将 0.5 g 低熔点琼脂糖 (LMP) 完全溶解在 50 ml 1 × PBS 中（对于此 1% 溶液，每个样品需要 1 ml 的体积加上一些额外的体积，因此如果要处理更多样品，请增加体积) 在玻璃瓶中用微波炉加热。务必将盖子松散地盖在瓶子上，并注意沸腾延迟。完全溶解后，将瓶子置于 37°C 水浴中以平衡至 37°C。

注意：保持水浴的正确温度至关重要——如果太冷，琼脂糖会凝固；如果使用太热，这将对细胞造成额外的损害。

5. 使用铅笔标记琼脂糖涂层的幻灯片。确保为每个检测条件（例如，时间点或 DNA 损伤剂的数量）准备至少一式两份或更好的三份载玻片。

6. 准备您的工作场所（见图 1）：

图 1. 进行彗星试验的工作场所的拟议布局。

显示了文中讨论的材料的最佳排列。

7. 用冰填充一个大的泡沫聚苯乙烯桶，将玻璃板水平放置在冰上，并使用水平仪检查以确保琼脂糖中的细胞均匀分布在整个载玻片上。

8. 将装有冷裂解缓冲液的 coplin 罐放入同一个桶中（或旁边不同的冰桶）。

9. 将一个空的 24 孔板放入第二个冰桶中，准备接收细胞悬浮液。

10. 准备好以下材料，准备好并放在 37°C 水浴旁边：P100 或 P200 移液管加吸头、P1000 移液管加吸头、在 37°C 平衡的熔融低熔点琼脂糖、标记的显微镜载玻片、盖玻片和计时器。

D. 细胞处理和琼脂糖包埋

根据研究问题，中性彗星试验可用于评估特定数量的快速和直接作用的 DNA 损伤剂（如电离辐射）引起的 DNA 损伤量（参见 D1）。此外，彗星试验可用于评估暴露于一定量的 DNA 损伤剂后的修复动力学（见 D2）以及细胞中存在的内源性 DNA 损伤的水平（例如，由于 DNA 的遗传消融修复途径）（见 D3）。确保在运行检测时包括适当的阳性和阴性对照。

D1) 评估用电离辐射处理细胞造成的 DNA 损伤

1. 通过将培养皿放在传真机柜中并按照制造商的详细说明提供计划的照射剂量来照射呈指数增长的细胞。作为阳性对照，使用 2 到 4 Gy 的剂量。

2. 胰蛋白酶消化细胞，加入完全培养基中和胰蛋白酶，计数细胞并在 15 ml Falcon 管中选择冷完全培养基稀释至 2 × 10 ⁵细胞/ml。

3. 将 Falcon 管放在冰上，将它们从细胞培养实验室转移到工作台上。

4. 为确保细胞悬浮均匀，小心地将 Falcon 管倒置几次（避免形成泡沫或剧烈摇晃以避免损坏细胞）；然后，将 250 µl 细胞悬浮液移入保持在冰上的 24 孔板（每个载玻片/样品 1 孔）的孔中。

5. 准备好装有玻璃板的冰桶，确保它仍然是水平的，拿到 P1000 和盖玻片，打开低熔点琼脂糖瓶（仍然保持在 37°C 水浴中）。

6. 将 1 ml LMP-琼脂糖加入孔中，小心移液以避免形成强烈气泡，吸出混合物，并将 1 ml 细胞琼脂糖混合物转移到适当的琼脂糖涂层显微镜载玻片上。立即用盖玻片覆盖，注意保持载玻片尽可能水平，将载玻片转移到冰上的冷玻璃板上，使琼脂糖凝胶。对每个孔重复此操作，直到所有细胞样本都转移到载玻片上。此过程在视频 1 中可视化。

视频 1. 将 LMP-琼脂糖中的细胞转移到显微镜载玻片上

7. 当所有样品都转移到载玻片上后，沿着纵轴（从第一个样品开始）滑动盖玻片，轻轻取下盖玻片，然后将载玻片放入科普林罐中，将它们浸入裂解缓冲液中。将样品保存在避光的冷（冰上）裂解缓冲液中至少 1 小时。

注意：如果样品始终保持在最高 4°C 并避光，此步骤可以延长至过夜孵育。避光旨在减少可能通过例如紫外线或其他来源产生的额外 DNA 损伤。

D2)电离辐射后修复动力学的评估

1. 每个时间点准备一盘呈指数增长的细胞。

2. 通过将培养皿放入传真机柜并按照制造商的详细说明照射呈指数增长的细胞（即大约 60-80% 汇合）。作为阳性对照，使用 2 到 4 Gy 的剂量。理想的照射剂量取决于您的研究问题和使用的细胞系，应通过实验确定。

3. 启动计时器以跟踪辐照后的时间点。

4. 将稍后收集的细胞培养皿放回培养箱中。

5. 胰蛋白酶消化并嵌入准备收集的细胞，如 D 节、D1 小节、步骤 2-7 所述。

6. 相应地继续收获和嵌入剩余时间点的细胞。

7. 当所有载玻片都在裂解缓冲液中时，在继续电泳之前将样品孵育至少 1 小时。

注意：如果样品始终保持在最高 4°C 并避光，此步骤可以延长至过夜孵育。

D3)评估培养细胞中的内源性 DNA 损伤

1. 胰蛋白酶消化呈指数生长的细胞（对照与例如KO 细胞），通过添加完全培养基中和胰蛋白酶，计数细胞并将它们在 15 ml Falcon 管中选择的完全培养基中稀释至 2 × 10 ⁵细胞/ml。

2. 要嵌入单元格，请按照 D 节 D1 小节步骤 2-7 中概述的过程进行操作。

重要提示：确保包含具有适当阳性和阴性对照（例如，电离辐射和无处理对照）的样品，以确保检测有效！

E. 彗星载玻片的电泳和染色

1. 准备适量的冷中性彗星电泳缓冲液并在4°C下储存直至需要。

2. 慢慢地从 coplin 罐中排出裂解缓冲液，并更换为新鲜的冷电泳缓冲液。然后排干电泳缓冲液并更换为新鲜的电泳缓冲液。再重复一次。最后，将载玻片在电泳缓冲液中在冰上孵育 60 分钟，避光。

3. 用新鲜的冷电泳缓冲液填充彗星缓冲罐至所需水平。将彗星幻灯片转移到彗星检测仪上，注意幻灯片的方向。确保所有幻灯片完全浸入缓冲区，并用虚拟幻灯片填充剩余空间。

4. 关闭彗星装置的盖子并在 21 V 下运行 60 分钟（这将导致大约120 mA 电流）。

5. 用 dH ₂O填充科普林罐。

6. 电泳后，从罐中取出载玻片并将它们转移到含有 dH ₂O的 coplin 罐中。

7. 孵育 5 分钟，然后排出 dH ₂O，小心地更换为新鲜的 dH ₂O。重复一次。

8. 与此同时，准备足够的彗星染色溶液（每张幻灯片大约 600 µl 加上一点额外的）。保持避光。

9. 将载玻片转移到内衬纸巾的托盘上，注意将它们尽可能平放。

10. 用大约 600 µl 染色溶液覆盖每张载玻片（确保整个琼脂糖部分都被溶液覆盖），用箔纸或盖子盖住托盘以避光，并在室温下孵育 20 分钟。

11. 倒出染色溶液，然后将每张幻灯片快速浸入新鲜的 dH ₂O。

12. 让幻灯片在一夜之间风干，避光。

F. 彗星滑坡的成像和分析

1. 在荧光显微镜上对载玻片成像，从整个载玻片上随机选取的不同视野以 10 倍或 20 倍放大倍率拍照。一定要使用曝光和光线强度，以便从背景中清楚地看到彗星，并尽可能地聚焦。每个条件的图像绝对最少 50 个细胞，但优先至少 100 个细胞或更多。为每张幻灯片保留单独的图像文件夹，其中包含不同字段的所有单独图像。在每张幻灯片的一个文件夹中将所有单个图像保存为 tiff 文件。

2. 使用适用于斐济的 OpenComet 插件分析图像，如下所示。

3. 打开 OpenComet 插件。

4. 选择输入文件夹（可以一次选择和分析一张幻灯片的所有图像）和输出文件目录。

5. 使用“自动”寻头模式，单击运行。此分析的结果将汇总在一个 Excel 文件中，该文件保存在先前选择的输出文件目录中。

6. 检查是否已正确检测到所有彗星并取消选择那些显然需要排除/不正确的彗星（例如，人工制品和非彗星已被评分的碎片、多个核体的叠加、头部错误的彗星定义或类似）通过单击它们。OpenComet 将以红色勾勒出每颗定期检测到的彗星（头部周围有一个红色圆圈，尾部有一条红线，见图 2A 和 2B）。除此之外，还有一条绿线表示检测为头部的信号的强度分布，还有一条蓝线表示检测为尾部的信号。有时，软件不确定某物是否是正确检测到的彗星（例如，异常的头部）。在这种情况下，OpenComet 将用黄色勾勒出这些“异常值”（图 2C 和 2D）。然而，形状也有可能被错误地评分，如图 2E 所示。在这里，非常低强度的信号被错误地评分为具有微小的头部并且大部分信号位于尾部。包含这样的形状会强烈影响结果，特别是如果这种情况发生不止一次或者每个条件只评估几个细胞。如果 OpenComet 无法分析形状（例如，如果两个或更多彗星彼此靠得太近或重叠），则形状将以灰色勾勒出轮廓（图 2F）。对于您通过单击取消选择/排除的那些彗星，也会发生同样的情况。仔细检查每颗彗星非常重要，因为错误评估的彗星会严重影响结果。

图 2. 使用 OpenComet 插件分析的彗星图像示例，该插件运行“自动”寻头模式和可能的结果图。

这些数据是在 4 Gy 照射后使用 Tig-1 人原代成纤维细胞获得的。A) OpenComet 用红色勾勒出每颗经常检测到的彗星，头部周围有一个红色圆圈，尾部有一条红线。绿线表示头部信号的强度分布，蓝线表示尾部信号。红色数字表示量化表中列出的单个彗星。B) 显示控制单元格的代表性图片。显然，这些细胞在尾部显示的 DNA 比 A) 中的细胞少得多，后者用电离辐射处理。C) 和 D) 黄色形状表示软件不确定彗星的正确检测。一定要目视检查这些彗星，并酌情排除/包括在内。E) 彗星形状的错误评分示例。非常低强度的信号被错误地评分为具有微小的头部和尾部的大部分信号。包含这样的形状会强烈影响结果。F) 灰色形状表示 OpenComet 无法勾勒出彗星的轮廓，例如，因为单元太靠近。GH) 在 Excel 文件中获得的结果可以绘制 (G) 作为重复或三次重复的平均值，这些重复或三次重复分析为尾、尾矩或橄榄矩中 DNA 的百分比或 (H) 作为单个数据点（例如., 50 个被量化的细胞）。

7. 仔细检查所有幻灯片上的所有彗星后，单击“更新”。这将生成带有后缀“_update”的第二个 Excel 工作表，其中考虑了已排除的彗星。

8. 此 Excel 表格包含所分析载玻片的所有彗星图像的所有值。最后几行是所有检测到的彗星的平均值、中值、标准偏差、最小值和最大值，分为仅所有正常彗星或正常和异常彗星。选择使用这些值中的哪一个取决于您是否同意包含异常值的值。通常，这两个值彼此非常相似。

9. 绘制结果的方法有两种：首先，您可以计算重复或三次重复的平均值，这些重复或三次重复分析的结果为尾、尾矩或橄榄矩中 DNA 的百分比，例如，使用条形图。重复整个检测至少两次，以获得每个数据点的三个或更多独立值（图 2G）。其次，您还可以绘制整个检测至少 3 次重复的所有单个数据点（例如，量化的 50 个细胞）（图 2H）。

注：尾矩描述的是彗尾长度乘以尾部 DNA 百分比的乘积，而橄榄矩是尾部 DNA 总百分比与质量中心距离的乘积头部和尾部区域。橄榄矩对于描述细胞群内的异质性特别有用，因为橄榄矩可以发现 DNA 在尾部分布的变化。在所有三个选项中，尾部 DNA 的百分比是大多数研究人员认为最直观的测量方法。

10. 要测试各组之间是否存在显着差异，您可以在仅比较两个组时使用 Student t检验。当比较三个或更多组时，使用单向方差分析，然后使用例如Bonferroni 的多重比较检验。

11. 在发布彗星分析数据时，强烈建议遵守最近刚刚发布的“彗星分析报告的最低信息 (MIRCA)”指南，以确保在实验室之间更好地解释、验证和再现结果（Moller等al ., 2020)。

食谱

1. 用于中性彗星试验的裂解缓冲液

a. 通过溶解 146.1 克 NaCl（最终：2.5 M）、37.2 克 EDTA 二钠盐（C ₁₀H ₁₄N ₂Na ₂O ₈·2H ₂O ，最终：100 mM）、1.2 克 Tris 碱来制备“预混物” （最终：10 mM）和 10 g N-月桂酰肌氨酸（最终：1%）在 800 ml dH ₂O 中。

b. 一旦所有固体溶解，通过滴加 5 M NaOH 将 pH 值调节至 9.5。通过添加 dH ₂O将体积调节至 1 L，并在 4°C 下储存。

c. 要在使用前制备裂解缓冲液的“完整溶液”，将 1 ml DMSO 和 0.5 ml Triton X-100 添加到 98.5 ml 冷裂解缓冲液中。

2. 用于中性彗星试验的电泳缓冲液

a. 准备单独的库存溶液：1 M 醋酸钠（82.03 克 C ₂H ₃NaO ₂在 1 L dH ₂O 中）、1 M Tris-HCl pH 8.3（121.14 克 Tris 碱在 1 L dH ₂O 中；调整 pH使用 HCl 滴加至 8.3)。

b. 要制备电泳缓冲液（最终成分：300 mM 醋酸钠 (C ₂H ₃NaO ₂)、100 mM Tris-HCl pH 8.3），添加 300 ml 1 M 醋酸钠和 100 ml 1 M Tris-HCl pH 8.3至600毫升冷dH ₂O；储存在 4°C 直到需要。

3. 彗星染色液

使用前在 dH ₂O 中以1:10,000 的比例稀释 SYBR Gold 。避光。

4. PBS（磷酸盐缓冲盐水）

a. 要制备 10 × PBS 储备溶液，请溶解 80 g NaCl、2 g KCl、26.8 g Na ₂HPO ₄·7H ₂O 和 2.4 g KH ₂PO ₄在 800 ml dH ₂O 中。使用 HCl 将 pH 值调节至 7.4，添加 dH ₂O 直至 1 L，高压灭菌以储存。

b. 要制备 1× PBS 工作溶液，请用 900 ml dH ₂O稀释 100 ml 10× PBS 储备溶液。

致谢

作者希望感谢以下资助机构支持 EM 小组的研究：瑞士国家科学基金会、Promedica Stiftung Chur、Sassella Stiftung 和 Kurt und Senta Herrmann Stiftung。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

参考

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3. Clementi, E.、Inglin, L.、Beebe, E.、Gsell, C.、Garajova, Z. 和 Markkanen, E.（2020 年）。持续的 DNA 损伤触发综合应激反应的激活，以促进营养限制下的细胞存活。BMC 生物学18（1）：36。

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10. Moller, P., Azqueta, A., Boutet-Robinet, E., Koppen, G., Bonassi, S., Milic, M., Gajski, G., Costa, S., Teixeira, JP, Costa Pereira, C 。，等人。(2020)。彗星检测报告的最低信息 (MIRCA)：描述彗星检测程序和结果的建议。国家议定书 15(12)：3817-3826。

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