材料和试剂

EZSPHERE Dish 100 mm Type 900（AGC Techno Glass，IWAKI，目录号：4020-900）

EZSPHERE Dish 35 mm 903 型（AGC Techno Glass，IWAKI，目录号：4000-903）

EZ-BindShut II 100 mm 碟（AGC Techno Glass，IWAKI，目录号：4020-800LP）

细胞培养 T25 烧瓶（AGC Techno Glass，IWAKI，目录号：3100-025）

5 ml Pipet（AGC Techno Glass，IWAKI，目录号：7103-005）

细胞刮刀（AGC Techno Glass，IWAKI，目录号：9010-320）

70 μm 细胞过滤器（Corning，Falcon，目录号：352350）

巴斯德移液器（AGC Techno Glass，IWAKI，目录号：IK-PAS-9P）

人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 菌株 253G1 和 201B7 (iPS Academia Japan)

维持培养基 mTeSR1（Stemcell Technologies，目录号：5850）

Biolaminin 521 LN（LN521）（BioLamina，目录号：LN521-03）

DPBS（FUJIFILM Wako Pure Chemical，Wako，目录号：045-29795）

HBSS，无钙（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：14170112）

含 L-Gln 的 DMEM（4.5g/L 葡萄糖），不含丙酮酸钠，液体（Nacalai，目录号：08459-35）

0.5 mol/L-EDTA 溶液（pH 8.0）（Nacalai，目录号：06894-14）

胎牛血清，FBS（MP Biomedicals，CELLECT，目录号：2916154）

Accutase（默克，Sigma-Aldrich，目录号：A6964-100ML）

AccuMax（Innovative Cell Technologies，目录号：AM105）

TrypLE select Enzyme（1 ×），无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：12563011）

StemPro TM -34 SFM（1×）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：10639011）

青霉素-链霉素（10,000 U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：15140122）

L-谷氨酰胺（200 mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：25030081）

全转铁蛋白人（默克，Sigma-Aldrich，目录号：T0665-100MG）

L-抗坏血酸（默克，Sigma-Aldrich，目录号：A92902-100MG）

1-硫代甘油（默克，Sigma-Aldrich，目录号：M6145-25ML）

ROCK抑制剂Y-27632（Wako Pure Chemical Industries，Wako，目录号：253-00513）

重组人 BMP-4 蛋白（Bio-Techne，R&D Systems，目录号：314-BP-010）

成纤维细胞生长因子（碱性），人，重组（154 aa）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，Wako，目录号：064-04541）

重组人 VEGF 165 蛋白（Bio-Techne，R&D Systems，目录号：293-VE-010）

重组人/小鼠/大鼠激活素 A 蛋白（Bio-Techne，R&D Systems，目录号：338-AC-010）

Stemolecule Wnt Inhibitor IWP-4（REPROCELL USA，Stemgent，目录号：04-0036）

DNase I，Bovine Pancreas（Merck，Millipore，目录号：260913）

30 w/v% 白蛋白 D-PBS（-）溶液，来自牛血清（BSA），无脂肪酸（FUJIFILM Wako Pure Chemical，Wako，目录号：015-23871）

4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液（Wako Pure Chemical Industries，Wako，目录号：163-20145）

流式细胞术分析中使用的抗体（表 1）

表 1. 流式细胞术分析中使用的抗体抗体经销商猫。

稀释比例APC-KDR生物传奇3599152.5:100APC-小鼠 IgG1，kappa 同种型对照生物传奇4001212.5:100PE-PDGFRα生物传奇3235055:100PE-小鼠 IgG1，kappa 同种型对照生物传奇4001135:100PE抗心肌肌钙蛋白TBD Pharmingen5647672.5:100PE-同型对照BD Pharmingen5546802.5:100 细胞培养试剂（见配方）

细胞因子和小分子化合物（见食谱）

改良的 StemPro-34（见配方）

球体形成介质（见配方）

阶段 1 培养基（2×）（见配方）

Stage-2 培养基（见食谱）

第 3 阶段培养基（见食谱）

设备层流罩（日立，型号：SCV-Class II type A/B）

水浴（AS ONE Corporation，型号：TR-1AR）

TC10 自动细胞计数器（Bio-Rad，目录号：145-0001）

EVOS FL 自动细胞成像系统（Life Technologies，EVOS，目录号：AMAFD1000）

EVOS Onstage 孵化器（Life Technologies，EVOS，目录号：AMC1000）

BD FACSVerse流式细胞仪（BD Bioscience，目录号：651154）

Pipet-Aid XPress 110V（Drummond Scientific Company，目录号：4-040-135）

离心机（Himac，CF16RX，型号：S101812）

涡流混合器 Vortex Gwnie 2（Scientific Industries，Inc.，目录号：SI-0236）

HERAcell CO 2培养箱（Kendro 实验室产品）

真空泵（型号 JN726 FT.18）

软件 ImageJ（NIH，https: //imagej.nih.gov/ij/ ）

AGDRec AG-桌面记录器（AmuseGraphics，http ://t-ishii.la.coocan.jp/hp/ag/index.html ）

FlowJo 软件（FlowJo LLC，https ://www.flowjo.com/ ）

程序

注意：在生物安全 2 级实验室的专用层流罩中进行培养操作。所有废物（管子、吸头、盘子）都应通过高压灭菌灭活，然后根据您的设施规则妥善处理。 hiPSCs 的高通量球体形成

在涂有 Biolaminin 521 LN 的烧瓶中培养培养基 mTeSR1 中的 hiPSC。

注意：在不添加 ROCK 抑制剂的情况下，将 hiPSC 作为单个细胞进行亚培养，而不是细胞团块。准备球体形成介质（参见配方：表 5）并在 37°C 的水浴中预热。

使用 90% 融合的 hiPSC。

从细胞中吸出培养基并用 2.5 ml 室温 DPBS 洗涤。对于抽吸，请使用带有吸管和适当管子的真空泵。

加入 2.5 ml TrypLE select 并在 37°C 下孵育 4 分钟。

抽吸 TrypLE 选择并添加 2.5 ml 球体形成培养基。

使用带有 5 ml 移液管的 Pipet-Aid 将培养基冲洗至细胞，从而分离细胞。如果细胞没有分离，用细胞刮刀刮掉它们。

用移液器冲洗细胞 2-8 次，将细胞团解离成单个细胞，并将它们收集到 15 ml 离心管中。

在 20°C 下以 100 × g离心4 分钟。

吸出上清液并用 1-5 ml 的球体形成培养基重悬沉淀。

使用 TC10 自动细胞计数器测量细胞密度。

用球体形成培养基将细胞稀释至 3 × 10 5 个细胞/ml的密度，并将 10 ml 悬浮细胞接种到 EZSPHERE Dish 100 mm Type 900 （见图 1）。

将 EZSPHERE 培养皿置于 37°C、5% CO 2培养箱中培养 24 小时。

图 1. 具有培养皿类型的微纤维容器“EZSPHERE”的图像心脏分化的第一阶段

进入心脏分化过程的第 1 阶段，球体形成后 24 ± 2 小时。

准备 Stage-1 培养基 (2x)（参见配方：表 6）并在 37°C 的水浴中预热。

从 CO 2培养箱中取出 EZSPHERE 培养皿，并在相差显微镜下检查 EZSPHERE 的每个微孔中是否形成了球体。

小心地将等体积 (10 ml) 的 Stage-1 培养基 (2x) 添加到球体中。

注意：我们建议用 10 ml 移液器吸取 10 ml Stage-1 培养基 (2x)，将移液器的尖端放在 EZSPHERE 盘中心周围的液面上，垂直放置移液器，然后小心地倒入培养基.将 EZSPHERE 培养皿放回 37°C、5% CO 2培养箱，培养 89 小时。

心脏分化的第 2 阶段

在上述第 1 阶段后 89 ± 2 小时，进入心脏分化过程的第 2 阶段。

准备 Stage-2 培养基（参见配方：表 7）和 IMEM 培养基，然后在 37°C 的水浴中预热。

从 EZSPHERE 盘中收获球状体到 15 毫升或 50 毫升管中。

（可选的）将球体转移到 100 毫米的平底培养皿中，并放置在显微镜的舞台上。

以圆周运动精细地摇动盘子，将球体放在盘子的中心。

用显微镜拍摄球体照片（见图 2）。

使用 ImageJ 软件测量球体的大小（参见数据分析 A）。

图 2. 在程序 C 中生成的 hiPSC 球体的图像和大小。EZSPHERE 盘 (A) 上的球体并转移到平底盘 (B) 上。球体 (μm) (C) 大小（直径）的直方图。松开管盖进行通风，将管置于 37°C CO 2培养箱中 10 分钟以沉淀球体。

使用移液器尽可能小心地从球体中取出上清液，并加入 5 ml 预热的 IMEM 培养基以洗涤球体。

在 20°C 下以 50 × g离心球体3 分钟，尽可能去除上清液。

将 20 ml 预热的 Stage-2 培养基添加到球体中，并将球体转移到 100 毫米的低细胞粘附培养皿 (EZ-BindShut II)。

将培养皿放入 37°C CO 2培养箱中。

注意：我们建议来回和左右摇动盘子 3 次，使球体均匀地分布在盘子中。如上所述，每天早晚摇动盘子，使球体均匀分散。

心脏分化和球体重新聚集的第 3 阶段

注意：球体的重新聚集增加了心脏分化过程中的纯度。作为阴性对照，不要在这一步重新聚合球体。为了确认重新聚集的效果，在程序 G 后通过流式细胞术分析 CTNT 阳性 iPS-CM 的纯度。在心脏分化的第 6 天，进入第 3 阶段以重新聚集球体。

注意：虽然建议在第 6 天执行此重新聚合步骤，但第 7 天也是可以接受的。准备第 3 阶段培养基（参见配方：表 8）并在 37°C 的水浴中预热。

将球体从 100 毫米 EZ-BindShut II 培养皿中收集到 50 毫升管中，并将其放入 37°C CO 2培养箱中 10 分钟以沉淀球体。

从收集的球体中取出上清液，加入 5 ml 室温 DPBS 清洗。

在 20°C 下以 50 × g离心3 分钟并去除上清液。

注意：对于阴性对照，跳过步骤 D6-D9 并继续执行步骤 D10。向球体中加入 1 ml Accutase，并在 37°C 的水浴中孵育 8 分钟，以将球体解离成单个细胞。在此孵育过程中，每 4 分钟将管涡旋 10 秒，剧烈混合细胞。

如果细胞聚集体在孵育 8 分钟后仍然存在，如上所述，强制额外孵育：使用移液器仅从单个分离的细胞中收集剩余的细胞聚集体，然后转移到新管中。然后，将双倍量（2 ml）的 Stage-3 培养基添加到单个解离的细胞中，并将 1 ml 的 Accutase 添加到聚集体中。在 37°C 的水浴中再次孵育聚集体 8 分钟。在孵化过程中, 如上所述, 大力混合细胞。

将双倍量（2 ml）的 Stage-3 培养基加入 Accutase 中的单个解离细胞，20°C 下以 200 × g离心4 分钟，然后去除上清液。

用 5 ml Stage-3 培养基重悬收集的细胞沉淀，并计算直径范围为 8-27 μm 的细胞数。如果细胞聚集体仍然存在，请使用 70 μm 细胞过滤器将其除去。

用 Stage-3 培养基将细胞稀释至 1 × 10 5细胞/ml的密度，并将 3 × 10 5细胞接种到 35 毫米 EZSPHERE 903 型培养皿中。

注意：对于阴性对照，在第 5 步从一个 100 毫米 EZ-BindShut II 培养皿中获得的球体中添加 20 毫升第 3 阶段培养基，并将每个 3 毫升分配到 35 毫米 EZ-BindShut II 培养皿中。每 2 或 3 天更换一半体积的培养基。

收获心肌细胞分化细胞

在心脏分化过程的第 10 至 14 天左右，收获获得的 hiPSC-CM 或阴性对照。

准备 4 ml 解离缓冲液（0.05% 胰蛋白酶-EDTA:AccuMax = 3:1）和 4 ml 淬灭缓冲液（DMEM:FBS 1:1 + 200 单位 ml -1的 DNase I）。

在显微镜下观察心脏球体的跳动状态（见视频 1 和 2）。

注意：随着 EZSPHERE 培养皿在室温下变冷，心脏球体的跳动可能会衰减。因此，我们建议在显微镜观察期间使用台上培养箱将培养皿保持在 37°C 的温度。观察使用EVOS FL Auto Cell Imaging System和EVOS台上培养箱，拍摄视频使用AGDRec AG-Desktop录像机。视频 1. 心脏球体的代表性视频重新聚合在 EZSPHERE 的微孔中。球体在第 6 天重新聚集并从第 8 天开始跳动。此视频是在第 14 天录制的。视频 2.重新聚合过程后恢复的跳动心脏球体的视频。心脏球体从 EZSPHERE 培养皿转移到平皿中，然后在它们跳动时进行录像。将球体收集到 15 毫升管中，静置 2-3 分钟，直到它们沉降。

去除上清液并加入 5 ml DPBS 清洗球体。

将管以 50 × g离心3 分钟并去除上清液，注意不要丢失球体。

向收集的球体中加入 1 ml 解离缓冲液，在 37°C 的水浴中孵育 8 分钟，将球体解离成单个细胞。在孵化过程中, 如上所述, 大力混合细胞。

如果孵育 8 分钟后细胞聚集体仍然存在，请执行额外的孵育步骤。使用移液器仅从单个分离的细胞中收集剩余的细胞聚集体，然后转移到新管中。然后，向解离的细胞中加入等体积（1 ml）的淬灭缓冲液，并在聚集体中加入 1 ml 的解离缓冲液。在 37°C 的水浴中再次孵育聚集体 8 分钟。在孵化过程中, 如上所述, 大力混合细胞。

向解离的细胞中加入等体积 (1 ml) 的淬灭缓冲液。

将管以 200 × g离心5 分钟，并通过小心移液去除上清液。不要使用抽吸器来防止吸入与一些破碎的细胞衍生 DNA 缠绕在一起的细胞聚集体。

对于细胞计数分析，用 DPBS 重悬收获的细胞。对于下一步的培养，用含有 10% FBS 的 DMEM 重悬细胞。

计算直径在 8-30 μm 内的细胞数。

心脏中胚层的流式细胞术分析。

使用第 6 天收获的细胞（步骤 D8）。

准备两管（#1 和#2）并将0.5 × 10 6细胞分别转移到每个管中，用于细胞染色及其同种控制。

准备 20 ml 流式细胞术缓冲液 [HBSS (-), 3% FBS, 0.03 mM EDTA]。

向细胞中加入 2 ml 流式细胞术缓冲液。

将细胞在20-25°C 下以 300 × g离心5 分钟并吸出上清液。

重复步骤 F4-F5。

在 100 μl 流式细胞术缓冲液中重悬 0.5 × 10 6细胞。

将 APC-KDR 和 PE-PDGFRα 抗体添加到管 #1 中进行细胞染色，并将 APC 和 PE-同型控制添加到管 #2 中进行同型控制（表 1）。

在室温下在黑暗中孵育每管 45 分钟。

在每个管中加入 2 ml 流式细胞术缓冲液。

将细胞在20-25°C 下以 300 × g离心5 分钟，然后吸出 DPBS。

重复步骤 F10-F11。

在 300 μl 流式细胞术缓冲液中重悬细胞。

使用流式细胞仪 (BD FACS Verse) 测量细胞并使用 FlowJo 软件分析数据 (图 3)。

图 3. iPSC 衍生的心脏中胚层在第 6 天的代表性流式细胞仪配置文件。使用流式细胞仪 (BD FACS Verse) 获取事件并使用 FlowJo 软件进行分析。首先，主要群体是通过 SSC 与 FSC 点图 (A) 中的门控选择的。显示了每种抗体的直方图：APC-KDR (B) 和 PE-PDGFRα (C)。该图显示了同种型对照（空心直方图）与染色样品（红色直方图）。第 6 天出现的主要群体是 KDR 和 PDGFRα 阳性（5.7% 的细胞为 KDR高，71.7% 的细胞为 KDR低，86.7%的细胞为PDGFRα + ）。该结果表明第 6 天存在的主要群体被认为是心脏中胚层样细胞。 hiPSC 衍生的心肌细胞 (hiPSC-CM) 的流式细胞术分析

使用 1 × 10 6在步骤 E10 中获得的分化或阴性对照细胞。

注意：如果细胞是在培养基中收获的，请用 DPBS 清洗。将细胞在20-25°C 下以 300 × g离心5 分钟，然后吸出上清液。

加入 200 μl 4% 磷酸多聚甲醛缓冲溶液，室温孵育 20 分钟以固定细胞。

向细胞中加入 2 ml DPBS，并在 20-25°C 下以 300 × g离心5 分钟。

取出含有多聚甲醛溶液的上清液，将其丢弃到适当的废液瓶中。

在 2 ml DPBS 中重悬细胞沉淀。细胞可以在这一步储存长达 7 天。

将细胞在20-25 °C 下以 300 x g离心5 分钟，并吸出上清液。

将细胞沉淀重悬在 200 μl（每 100 μl 0.5 × 10 6 个细胞）的流式细胞术透化/洗涤缓冲液 I 中，并在室温下孵育 30 分钟。

将 100 μl（0.5 × 10 6 个细胞）的重悬细胞转移到 96 孔圆底板的一个孔中作为染色样品。将剩余的 100 μl（0.5 × 10 6细胞）重悬细胞转移到另一个 96 孔圆底板的一个孔中作为同种型对照。

向样品中加入 2.5 μl 的 PE 抗心脏肌钙蛋白 T 抗体，向同型对照中加入 2.5 μl 的 PE 同型对照抗体（表 1），并在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。

向每个孔中加入 100 μl 流式细胞术透化/洗涤缓冲液 I，并在室温下在黑暗中轻轻摇动板 5 分钟。

将板在20-25°C 下以 300 × g离心5 分钟，并通过倾析或移液去除上清液。

小心地将 200 μl 流式细胞术透化/洗涤缓冲液 I 添加到每个板中，不要破坏细胞沉淀。

将板在20-25°C 下以 300 × g离心5 分钟，并通过倾析或移液去除每个板的上清液。

重复步骤 G13-G14。

在每个板中用 200 μl DPBS 重悬细胞沉淀并混合均匀。

使用流式细胞仪 (BD FACSVerse) 测量每个板中的细胞并使用 FlowJo 软件分析数据 (图 4)。

图 4. hiPSC-CM 的代表性流式细胞仪配置文件。使用流式细胞仪 (BD FACS Verse) 获取事件并使用 FlowJo 软件进行分析。首先，主要群体是通过 SSC 与 FSC 点图 (A) 中的门控选择的。直方图分别显示了无重新聚集的阴性对照（左）和重新聚集的球体（右）（B）的心脏肌钙蛋白 T 阳性 hiPSC-CM 群体。该图显示了同种型对照（开放直方图）与染色样品（红色直方图）。直方图显示，与阴性对照相比，重新聚集的球体中心脏肌钙蛋白-T hiPSC-MS 的纯度增加。数据分析使用 ImageJ 软件测量球体大小

图 5 显示了球体尺寸分析的流程。使用 ImageJ 软件打开球体图像。

如果距离以像素显示，请使用 ImageJ 中的“设置比例”命令设置已知距离。例如，450 像素 = 1,000 μm。

将图像类型转换为 8 位。

（选项）如果下一步“双极化”不起作用，则使用“高斯模糊（Sigma 2.0）”命令过滤图像。

使用“阈值”命令对图像进行双极化。

（选项）使用“分水岭”命令分割重叠的球体。

要测量每个球体的表面积，请使用“分析粒子”和参数“尺寸：706.5 (Φ30 μm)” – 无穷大、“圆度：”0.50-1.00、“显示：”轮廓；选中“显示结果”、“边缘排除”和“包括孔”。

（可选）在原始图像中叠加轮廓以确保正确识别球体。

使用“Lookup Tables > Green”命令更改大纲的颜色。

使用“Lookup Table > Invert LUT”命令反转轮廓的颜色。

使用“图像计算器（图像 1：原始图像，图像 2：轮廓）”命令在原始图像上叠加轮廓。

用 Excel 分析由每个球体的表面积组成的数据集。

图 5. 在数据分析 A 中使用 ImageJ 分析球体大小的流程食谱细胞培养试剂和培养基制备试剂（表 2）

表 2. 试剂制备试剂制备方法库存集中度L-抗坏血酸在 4°C 下用 5 mg/ml 的预冷超纯水溶解 L-抗坏血酸，并使用涡旋混合器混合直至完全溶解。使用 22 μm 注射器过滤器进行消毒。将溶液分装成 1 ml 体积并在 -20°C 下冷冻。制备培养基时，将溶液在 4°C 或冰上避光解冻。5 毫克/毫升硫代甘油 (MTG)将 MTG 分装至 1 ml 体积并在 -20°C 下冷冻。在 3 个月内使用解冻的 MTG。为防止 MTG 氧化，尽量减少库存管盖的打开和关闭。在培养基制备当天，用 1 ml StemPro-34 稀释 13 μl MTG。100%(1.3%(v/v) 使用中)转铁蛋白用无菌超纯水以 30 mg/ml 的浓度溶解转铁蛋白。将转铁蛋白溶液等分至 1 ml，并在 -20°C 下冷冻。30 毫克/毫升4 mM 盐酸 (HCl)，0.1% BSA 缓冲液在通风室中，将 30 μl 6.0 N HCl 转移到 50 ml 灭菌超纯水中。使用 22 μm 注射器过滤器进行消毒。将 1 ml 30% BSA 添加到 30 ml HCl 溶液中。4 毫米盐酸0.1% BSADPBS，0.1% BSA 缓冲液将 10 μl 30% BSA 添加到 3 ml DPBS 中。0.1% BSA 细胞因子和小分子化合物（表 3）

表 3. 细胞因子和小分子化合物的储备制备生长因子/小分子化合物缓冲器库存集中度BMP44 mM 盐酸，0.1% BSA10 微克/毫升bFGFPBS，0.1% BSA10 微克/毫升血管内皮生长因子PBS，0.1% BSA5微克/毫升激活素APBS，0.1% BSA10 微克/毫升IWP-4二甲基亚砜1.2 毫米使用适当的缓冲液以表 2 中所示的库存浓度溶解细胞因子或小分子化合物。如果需要，将每种溶液分装并在 -20°C 下冷冻。改良的 StemPro-34（表 4）

表 4. 改良 StemPro-34 的制备组合物最终浓度体积StemPro-34——48.5 毫升笔/链球菌 (100×)1×500 微升L-谷氨酰胺 (100×)1×500 微升转铁蛋白（30 毫克/毫升）150 微克/毫升250 微升抗坏血酸 (5 毫克/毫升)50 微克/毫升500 微升1.3% (v/v) MTG0.0039% (v/v)150 微升球体形成介质（表 5）

表 5. 球体形成介质的制备组合物最终浓度体积改良的 StemPro-34——50毫升BMP4 (10 微克/毫升)1 纳克/毫升5 微升Y-27632 (10 mM)10微米50 微升 Stage-1 培养基 (2×) (表 6)

表 6. Stage-1 培养基 (2×) 的制备组合物最终浓度体积改良的 StemPro-34——50毫升BMP4 (10 微克/毫升)20 纳克/毫升100 微升bFGF (10 微克/毫升)10 纳克/毫升50 微升激活素 A（10 微克/毫升）12 纳克/毫升60 微升 Stage-2 培养基（表 7）

表 7. Stage-2 培养基的制备组合物最终浓度体积改良的 StemPro-34——50毫升VEGF（5微克/毫升）10 纳克/毫升100 微升IWP-4 (1.2 毫米)2.5微米104 微升第 3 阶段培养基（表 8）

表 8. Stage-3 培养基的制备组合物最终浓度体积改良的 StemPro-34——50毫升VEGF（5微克/毫升）10 纳克/毫升100 微升bFGF (10 微克/毫升)5 纳克/毫升25 微升致谢这项工作的一部分得到了日本医学研究与开发机构 (AMED) 的“实现再生医学网络计划”的支持。该协议改编自先前发表的作品（Miwa等人，2020 年）。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

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