材料和试剂

密封膜（Roth，目录号：H666.1）
用于细胞培养的密封箔（Roth，目录号：EN85.1）
血清移液管 10 ml（Sarstedt，目录号：86.1254.025）
血清移液管 10 ml 无尖端（Sarstedt，目录号：86.1688.010）
吸瓶1,000毫升（Roth，目录号：NY68.1）
注射器过滤器，0.22 µm（Roth，目录号：KH54.1）
铝箔（Roth，目录号：2596.1）
Büchner漏斗，70 ml（Roth，目录号：XX45.1）
细胞培养 24 孔板（Greiner，目录号：662160）
纤维素塞“Zellstoppers”（对角线，目录号：ZE153）
圆形滤纸，113A 型，55 毫米（Roth，目录号：AP74.1）
带 Luer-Lock 接头的一次性注射器 20 ml（Roth，目录号：T550.1）
烧瓶，250 毫升，带挡板（对角线，目录号：2121636S1）
带挡板的 500 毫升烧瓶（对角线，目录号：2121644S1）
密封垫圈（Roth，目录号：9757.1 [33 mm]；9758.1 [41 mm]）
Nunc TM MicroWell TM 96 孔，Nunclon Delta 处理，平底微孔板（ThermoFisher Scientific，目录号：137101）
巴斯德移液管，2 ml（Roth，目录号：4522.1）
Pep13 肽（Thermo Fisher Scientific，氨基酸序列：VWNQPVRGFKVYE）
培养皿，94/16 mm（Greiner，目录号：633180）
移液器吸头 Gilson（Greiner，目录号：740290 [1,000 µl]；739290 [200 µl]）
移液器吸头 Starlab（TipOne ® ，目录号：1110-3000 [10/20 µl]）
反应管 1.5 ml（Sarstedt，目录号：72706）
反应管 50 ml（Greiner，目录号：227261）
Petroselinum creamum PC794愈伤组织培养物（DSMZ - Leibniz Institute，目录号：PC794）
植物琼脂（Duchefa，目录号：P1001.1000）
氢氧化钾，1 M KOH（Roth，目录号：9522.1）
水杨酸，C 7 H 6 O 3 （TCI，目录号：H1342）
测试化合物
包含维生素的 Gamborg B5 培养基（Duchefa，目录号：G0210.0050）
D-蔗糖，C 12 H 22 O 11 （Roth，目录号：4621.2）
洗手液（Roth，目录号：EH72.2）
七水硫酸镁，MgSO 4 ·7H 2 O（Roth，目录号：P027.1）
2,4-二氯苯氧基乙酸，C 8 H 6 Cl 2 O 3 （默克，目录号：8204510005）
二甲基亚砜，C 2 H 6 OS（Roth，目录号：A994.1）
乙醇，C 2 H 5 OH，≥99.5%，超纯（Roth，目录号：5054.4）
70% 乙醇（见配方）
2,4-二氯苯氧乙酸，0.2 mg/ml 原液（见配方）
硫酸镁，0.05 mg/ml 原液（见配方）
改良 Gamborg 的 B5 培养基（见食谱）
水中的水杨酸（水中的 SA），10 mM 储备溶液（参见配方，将等分试样储存在 -20°C 下）
DMSO 中的水杨酸（DMSO 中的 SA），80 mM 储备液（参见食谱，将等分试样储存在 -20°C 下）
Pep13，0.005 µM 储备溶液（参见配方，将等分试样储存在 -20°C）
愈伤组织培养基（见食谱）

设备

10-µl、100-µl 和 1,000-µl 微量移液器（ErgoOne、Starlab）
磁棒（Roth，目录号：2153.2）
手术刀（Roth，目录号：X003.1）
剪刀（Roth，目录号：5489.1）
量筒，1,000 ml（Roth，目录号：P153.1）
量筒，100 ml（Roth，目录号：P150.1）
分析天平（梅特勒托利多，型号：MS204）
高压釜（Systec，型号：DX65）
暗室，温度控制 (25°C)，带有两个摇床培养箱和带燃气燃烧器的洁净工作台（见下文）
超净工作台（IBS Tecomara，型号：NU-543-4000EC）
大型摇床培养箱，90 rpm，25°C（Infors HT，型号：Multitron Standard）
带丙烷气瓶（Westphalengas；11 kg）的安全实验室燃气燃烧器（Roth，目录号：AN82.1）
小型摇床培养箱，130 rpm，25°C（Infors HT，型号：Ecotron）
实验室真空系统（Fisher Scientific，型号：Welch Ilmvac TM LVS 210T，目录号：11882253）
磁力搅拌器（Roth，目录号：AAN2.1）
酶标仪（BMG Labtech，型号：CLARIOstar Plus）
pH计（梅特勒托利多，型号：SevenMulti TM ）
移液管灯泡（Roth，目录号：YX53.1）
移液器控制器（品牌，型号：accu-jet ® pro）
超纯水系统（Satorius，型号：arium ® pro VF）
紫外灯（Thermo Fisher Scientific，目录号：12813029）

软件

CLARIOstar Reader Control Software（通过酶标仪获得）
板：NUNC96
激发：335 nm（带宽：20）
二向色滤光片：365.2
发射：398 nm（带宽：20）
MARS 数据分析软件（通过酶标仪获得）
统计软件（例如，GraphPad Prism）

程序

欧芹细胞培养的生长和维持
设置欧芹细胞培养
无菌工作。在洁净工作台和暗室中，使用手术刀将 2-3 厘米的愈伤组织培养物（从 DSMZ 获得）转移到 250 毫升烧瓶中的 50 毫升新鲜制备的改良 Gamborg B5 培养基中。此外，将一块 1 × 1 厘米的愈伤组织转移到带有新鲜制备的改良甘博格 B5 琼脂的培养皿中。持续保存的细胞愈伤组织作为未来细胞培养重启的备份。
在暗室中的摇床培养箱（25°C，90 rpm）上孵育 250 毫升烧瓶和细胞培养物 10 天。
无菌工作。在超净工作台上，向培养物中加入 25 ml 改良 Gamborg's B5 培养基，并在 7 天和 14 天后重复此步骤。
再过 7 天后，使用 50 毫升塑料管将 35 毫升细胞培养物转移到 500 毫升烧瓶中的 120 毫升无菌（高压灭菌）改良 Gamborg B5 培养基中。
在暗室中的摇床培养箱（25°C，90 rpm）上孵育细胞培养物 7 天。
通过过滤 10 ml 细胞培养物来确定细胞鲜重，如下所示：
称量一个含有圆形滤纸的空培养皿。
组装吸瓶、密封垫圈和漏斗并连接到真空泵。
轻轻摇晃装有细胞培养物的烧瓶，使细胞尽可能均匀地分散在培养基中。
使用移液器控制器和 10 毫升无吸头血清移液器将 10 毫升细胞培养物缓慢转移到漏斗中的圆形滤纸上。施加真空 (150-200 帕斯卡) 并过滤 1 分钟。
将带有细胞的滤纸放在培养皿上，称重，并通过减去皮重（带有圆形滤纸的空培养皿）来确定细胞的鲜重。
如果细胞在一周内繁殖到 0.2 g 鲜重/ml，则开始每周培养细胞培养（步骤 A2）。
注意：如果重量差异很大，返回步骤 A1d 并转移更多（如果细胞鲜重太低）或少于（如果细胞鲜重太高）35 ml 细胞培养物。
细胞培养的每周繁殖
无菌工作。使用 50 毫升反应管，将 35 毫升培养 7 天的欧芹细胞培养物转移到装有挡板的 500 毫升烧瓶中，并装有 120 毫升已预热至 25°C 的无菌改良 Gamborg's B5 培养基。
注意：不要让细胞培养物保持不动超过 5 分钟。
可选：使用更多烧瓶重复步骤 A2a。
注意：在我们的实验室中，我们每周使用 4 个烧瓶：一个用于繁殖，三个用于执行高通量筛选。
在暗室的大型摇床培养箱（25°C，90 rpm）上培养细胞培养物。使用 3 天培养的培养物进行筛选实验，使用 7 天培养的培养物进行每周繁殖。
用于细胞培养的愈伤组织繁殖重新开始
无菌工作。每四个星期，使用手术刀将一块 1 × 1 厘米长的愈伤组织转移到含有甘博格 B5 琼脂的新鲜培养皿的中心。用密封膜密封培养皿，并在 25°C 的暗室中孵育。

使用欧芹细胞培养物高通量筛选防御引发诱导化合物
细胞复合处理
将化合物的粉末或晶体溶解在 DMSO 或无菌双蒸水中（取决于化合物在这些溶剂中的溶解度）。如果该物质已在溶液中，则继续下一步。
无菌工作。准备具有所需库存浓度的稀释系列。
注意：对于溶解在 DMSO 中的物质，每毫升细胞培养物最终应最多添加 2.5 µl。对于溶于水的物质，加入 1 ml 细胞培养物的体积不应超过 20 µl。
无菌工作。使用 1,000 µl 微量移液器和截短的移液器吸头将 3 天大的欧芹细胞培养物的 1 毫升等分试样从步骤 A2c（细胞鲜重约 0.1 克/毫升）转移到 24 孔板（图 1）。用箔纸密封板，然后将其放入暗室中的小型摇床培养箱（25°C，130 rpm）中，直至进一步处理。
注意：用剪刀剪掉约 1.3 厘米的尖端以扩大开口并对其进行高压灭菌。这确保了细胞的轻松和非侵入性转移。
无菌工作。用 DMSO 或水为细胞培养物提供适当的阴性对照。适当溶剂的最大体积应与化合物处理样品的最大体积相同。使用 20 µl 10 mM 水杨酸 (SA) 水溶液（参见配方）或 2.5 µl 80 mM SA DMSO（参见配方，最终浓度：200 µM）作为防御启动的阳性对照。对于候选化合物，用所需浓度的化合物处理细胞培养物的等分试样（图 2）。密封多孔板并将其放回摇床培养箱中。

图 1. 24 孔板中欧芹细胞培养物的等分试样。使用截短的移液管吸头将 1 毫升的 1 毫升欧芹细胞培养物转移到 24 孔板中。

用 Pep13 治疗
无菌工作。在测试化合物或溶剂存在下孵育 24 小时后，将 10 µl 0.005 µM Pep13（最终浓度：50 pM）或水（作为 Pep13 处理的对照）添加到足够的细胞培养物中（图 2）。
可选：为了进一步提高对启动特定化学品的识别，包括一个样品，其中测试化合物和溶剂在 24 小时预孵育期后一起添加。这可以从协同效应中区分引发反应。
密封板并将其放回摇床培养箱中。
呋喃香豆素荧光测定
从此，不再需要在暗房工作。再培养 24 小时后，将板放在工作台上，让细胞安定下来（约 30 秒）。将每个样品的 100 µl 无细胞上清液转移到 96 孔微量滴定板，并在酶标仪中测定分泌的呋喃香豆素在 335 nm 激发和 398 nm 发射下的相对荧光（图 2）。
可选：对于荧光的可视化，在紫外线下拍摄 24 孔板的照片 [例如，当放置在紫外线灯下时（图 3）]。

图 2. 使用欧芹细胞培养物对防御引发化合物进行高通量筛选的工作流程。将 3 天大的欧芹细胞培养物的 1 毫升等分试样转移到 24 孔板中。用溶解或稀释在 DMSO 或无菌双蒸水中的不同浓度（A、B、C）的测试化合物处理细胞培养物。使用 DMSO 或无菌双蒸水作为阴性对照 (NC)，使用 DMSO 中的 SA 或无菌双蒸水中的 SA 作为阳性（启动）控制（PC）。在暗室中的摇床培养箱（25°C，130 rpm）中孵育 24 小时后，将 10 µl 0.005 µM Pep13 添加到相应的细胞培养物等分试样中。再摇晃 24 小时后，将上清液转移到 96 孔微量滴定板，并在微孔板读数器中测定相对呋喃香豆素荧光。SA，水杨酸。图修改自 Schillheim等人。(2018)。

图 3. 在 24 孔板和紫外光下，欧芹细胞培养物等分试样中分泌的呋喃香豆素的荧光。24 孔板中的欧芹细胞培养物 1 毫升等分试样未经处理 (-) 或用 SA 处理 (+；最终浓度：200 µM)。24 小时后，不存在或存在 SA 的细胞培养等分试样未经处理 (-) 或补充 Pep13 (+；最终浓度：50 pM) 以激活呋喃香豆素合成和分泌。再过 24 小时后，将多孔板暴露在紫外线下并拍照。SA，水杨酸。

数据分析

对于每个实验，确定每个处理四个技术重复的相对呋喃香豆素荧光，并重复实验 3 次。对于每个处理，计算所有实验的平均值和标准偏差。通过执行单向方差分析（单向方差分析），然后使用适当的统计软件（例如，GraphPad Prism）进行事后学生t检验，对数据进行统计分析。

笔记

在任何指示的地方进行无菌操作是非常重要的。在每一步之前，在超净工作台上工作之前，先对双手进行消毒，并用 70% 乙醇对所有材料进行清洁和消毒。对于所有培养和繁殖步骤，使用燃气燃烧器的火焰对烧瓶、纤维素塞和手术刀进行消毒。转移细胞培养物时避免反应管和烧瓶的物理接触。

食谱

70%乙醇
将 350 ml 乙醇（≥99.5%，超纯）和双蒸水混合至 500 ml。
2,4-二氯苯氧乙酸（0.2 毫克/毫升储备溶液）
将 40 mg 2,4-二氯苯氧乙酸溶解在 1 ml 乙醇中（≥99.5%，超纯）。
添加双蒸水至 200 毫升。
硫酸镁（0.05 mg/ml 原液）
将 10 克七水硫酸镁溶解在 200 毫升双蒸水中。
改良 Gamborg 的 B5 培养基
3.16 克 Gamborg's B5 培养基，包括维生素
20 克 D-蔗糖
10 ml 0.2 mg/ml 2,4-二氯苯氧乙酸储备溶液
5 毫升 0.05 毫克/毫升硫酸镁原液
添加双蒸水至 1 L。
使用 1 M KOH（约 3 滴）将 pH 值调节至 5.5。
在 121°C 下高压灭菌 15 分钟（注意：最终温度设置为 80°C ）。
对于固体培养基，在高压灭菌前加入 10 g 植物琼脂。
SA 水溶液（10 mM 原液）
345.25 毫克 SA
添加双蒸水至 200 毫升。
用 1 M KOH 将 pH 值调节到 5.5。
用双蒸水填充至 250 毫升。
无菌过滤器并在 1.5 ml 反应管中分装。
储存在 -20°C 直至使用。
DMSO 中的 SA（80 mM 储备溶液）
276.2 毫克 SA
添加 DMSO 至 25 毫升。
分装在 1.5 毫升反应管中。
储存在 -20°C 直至使用。
Pep13（0.005 µM 原液）
4.055 毫克 Pep13
添加双蒸水至 50 毫升。
用双蒸水按 1:1,000 稀释。
过滤灭菌并分配到 1.5 毫升反应管中。
储存在 -20°C 直至使用。

致谢

我们要感谢我们的合作者，无论是公共的还是私人的，在过去的 25 年里，我们与他们一起使用欧芹细胞培养物发现了引发引发的化学反应，并帮助我们不断优化屏幕。该协议基于我们之前的出版物（Schillheim等人，2018 年；doi：10.1104/pp.17.00124）。

利益争夺

我们声明我们没有财务或非财务竞争利益。

参考

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