材料和试剂

1.硅管（ID=1 mm，OD=3 mm，润泽，中国）
2.硅管（ID=3.2 mm，OD=6.4 mm，润泽，中国）
3.蠕动泵管（ID=1.02 mm，OD=2.62 mm，Pharmed BPT，Sain-Gobain）
4.直式连接器（润泽，目录号：DI-016 ）
5.直式连接器（润泽，目录号：DI-032 ）
6.鲁尔接头（润泽，目录号小号：RH-G016 ; RH-M016 ）
7.针（规格：26G，皮下；BD，目录号：305111）
8.注射器（1毫升，BD，Lu er-Lock，目录号：309628）
9.硅胶胶（Advanced Silicone 2，GE密封胶）
10.封口膜（BEMIS，目录号：PM996）
11.金属箔（Maryya ，目录号：HC081260 ）
12. 10 μl接种环（Sangon Biotech，目录号：F619312 ）
13. 15 ml离心管（Sangon Biotech，目录号：F602888 ）
14.盖玻片小号（生工生物，目录号：F518117 ）
15.微孔板小号（热˚F isher，Nunc公司TM ，Ç atalog号：168055 ）
16. 0.22 μm注射器过滤器（Sangon Biotech ，目录号：F513163 ）
17. 2米升微型试管小号（Maxyclear Snapclock，爱思进，US）
18. LB肉汤（Sangon Biotech ，目录号：A507002 ）
19.氯化钙（Sangon Biotech ，目录号：A501330 ）
20.氯化钠（Sangon Biotech ，目录号：A100241 ）
21. QIAamp DNA Micro Kit（QIAGEN，目录号：56304 ）
22. RNeasy Mini Kit（QIAGEN，目录号：74104 ）

设备

蠕动泵（200 系列 16 通道泵，Watson Marlow）
酶标仪（星火® ，Tecan公司，瑞士）
Flowcytomet ë R（CytoFLEX，美国Beckman公司）
探针超声波仪（SONICS，米Odel等：VCX750 ）
离心机仪（Eppendorf，米Odel等：5418R ）
生物安全柜，BSC（MSC-优势TM II，热电˚F isher，USA）
高压釜（Z EAL方式，米Odel等：GR-60DA ）
共聚焦激光扫描中号icroscop ë ，CLSM（蔡司，米Odel等：LSM900 ）

软件

Imaris (Bitplane, Oxford Instrument)
ImageJ ( https://imagej.net/ )
Comstat 2 ( http://www.comstat.dk/ )

程序

管式生物膜反应器（图 1 ，图 S1）

图1的插图中管生物膜反应器

注意小号：
管生物膜反应器包括以下部分中的序列：奶瓶，喂食管（ID = 1mm）的，蠕动泵管（ID = 1.02 mm）时，注射器过滤器（0.2 μ M），注射管（ID = 1 mm）时，生物膜管（ID = 3.2毫米），废液管（ID = 1mm）的，和废液瓶。
这种设置，除了各部位⑤和⑦ ，可重复使用的重复实验。有关清理程序，请参阅 H 部分。
管道生物膜反应器不允许在spati Ø生物膜的时间成像观测。他们特别满足收获的需要一个大量的生物质的-组学分析。

进料管连接到该蠕动泵管的直线连接器。确保送料管的长度与奶瓶的高度兼容。
使用女性 Luer 接头将泵管的另一侧连接到注射器过滤器。
所述过滤器的另一侧连接到所述与注射器阳配件注射管。
使用减少直连接器将注射管连接到生物膜管。生物膜管道的长度取决于该实验设计。
使用减少的直连接器将生物膜管连接到废物管。
包裹组装部分（1-5）在金属箔和高压釜至steriliz È 。
新鲜制备中十分之一LB肉汤的奶瓶和高压釜至steriliz È 。
高压灭菌废液瓶，并在使用前倒入漂白剂。
紫外线-在使用前对生物安全柜中的封口膜 (10 cm × 10 cm) 和金属箔 (15 cm × 15 cm) 进行消毒。
将进料管进入奶瓶，并确保该管道到达瓶底。P花边废液管到废液瓶，并确保该管道是接近的瓶颈，而不是底部。用消毒的封口膜和金属箔盖住每个瓶子。这一步必须进行的生物安全柜。
将泵管放在蠕动泵上，并以最大速度启动泵，用生长培养基清洗系统。确保该系统设置流量恢复正常之前，无气泡。
将带有蠕动泵的管状生物膜反应器转移到温控培养箱中。确保该生物膜管是在一个类似水平的瓶颈的废液瓶，以避免任何回流。

3通道流通池生物膜反应器（图2 ，图S2）

图2的示意图的3通道流动池生物膜反应器

注意小号：
Ť他3通道流动池系统包含在序列中的以下部分：奶瓶，喂食管（ID = 1mm）的，蠕动泵管（ID = 1.02 mm）时，中间管（ID = 1 mm）时，注射器过滤器（ 0.2 μ M），injec灰管（ID = 1 mm）时，生物膜管（ID = 3.2毫米），废液管（ID = 1mm）的，和浪费瓶。
这种设置的所有部件，除⑤ ，可重复使用的重复实验。第⑦部分可以通过取下盖玻片并用 70% 乙醇清洗来重复使用。对于t他重用其他部分，是指H节对的清理过程。
3 通道生物膜系统最常用于研究铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等的生物膜形成和活性。此设置与传统版本略有不同；第Ë气泡捕捉器通过注射器过滤器和第取代Ë在奶瓶空气连接管被除去。根据作者的经验，气泡捕集器是泄漏的主要原因，移除空气连接管不会影响介质中的氧气含量。此装置是用于可行的非侵入性spati ö颞生物膜形态和社区的组合物，观察人虽然biof不推荐ILM收获。

洗3通道流动池用乙醇和干燥它的通风橱。确保该表面的流动池是干净的，在装配时干燥。
在 3 通道流通池的壁上放置一层薄薄的硅胶，并在顶部放置盖玻片。小心地将盖玻片压向流通池底部，直到它完全密封，密封区域没有任何气泡。将密封的流通池在室温下放置一夜，使胶水完全干燥。
供给管道连接的蠕动泵管具有直的连接器。
将泵管的另一侧连接到带有直连接器的中间管。确保该中间管的长度允许流动池单元被移动到的阶段的共焦显微镜。
的另一端连接所述中间管连接到所述与注射器阴配件的注射器过滤器。
所述过滤器的另一侧连接到所述与注射器阳配件注射管。
将注射管连接到 3 通道l流通池的一个通道。
将废液管连接到流通池通道的另一侧。
组装与管道的奶瓶，废液瓶，以及蠕动泵使用相同的程序作为描述用于管生物膜反应器。

回收流通池系统（图 3）

图3的示意图的循环流动池系统

注意小号：
Ť他再循环流动池系统包含在序列中的以下部分：奶瓶，喂食管（ID = 1 mm）时，蠕动泵管（ID = 1.02 mm）时，流动池反应器，废液管（ID = 1mm）的，带回收管的废液瓶和带供应管的新鲜培养基瓶。
这种设置，除了各部位⑤和⑦ ，可重复使用的重复实验。有关清理程序，请参阅 H 部分。
循环流-细胞系统通常用于研究的毒物和环境化合物的生物修复，以期以模仿王的废水处理厂。第⑦部分不限于管道和/或 3 通道室。新鲜培养基与废弃培养基的补料比例应根据每个项目进行调整。

Assembl Ë按照相同的程序1-5“装配的部分中的供电部的管反应器。”
Assembl Ë循环废料部分：连接进给管与一个注射器阴配件的注射器过滤器; 连接泵管到另一侧的针筒式过滤器与一个公鲁尔接头; 用直接头将泵管的另一侧连接到另一条进料管（回收进料管）。
Assembl Ë循环新鲜培养基部分：连接进给管与直连接器的泵管; 用直接头将泵管的另一侧连接到另一条进料管（回收进料管）。
单独包装每个部分中的金属箔和高压釜至steriliz È 。
在喂养瓶和新鲜培养基瓶中新鲜制备十分之一的 LB 肉汤。
对废液瓶进行高压灭菌。
紫外线-在使用前对生物安全柜中的封口膜 (10 cm × 10 cm) 和金属箔 (15 cm × 15 cm) 进行消毒。
将三个管材进入奶瓶，废液瓶，并且新鲜的介质瓶，分别。确保该管道到达每个瓶子的底部。将废液管插入废液瓶，并确保该管道是接近的瓶颈，而不是底部。将来自两个循环喂养管末端的废物和新鲜介质部件到奶瓶。确保这将油管接近的瓶颈，而不是底部。用消毒的封口膜和金属箔盖住每个瓶子。这一步必须进行的生物安全柜。
将输送泵管到喂养蠕动泵和将两个回收和进料管小号到回收蠕动泵。
调整输送泵的旋转速度成为这两次循环泵。
首先以最高速度启动进料泵，用生长培养基清洗系统。确保该系统设置流量恢复正常之前，无气泡。
将整个系统转移到温控培养箱中并启动两个泵。

生物膜接种培养（图S3）
制备接种物：在培养细菌过夜的适当的温度和稀到所述用生长培养基所需细胞密度。通常，铜绿假单胞菌的1 × 10 8 个细胞/ml可以保证强大的生物膜。
加载细菌接种我n要利用26G针头的注射器。确保该体积的接种体填充Š的生物膜反应器。
停止蠕动泵和接种前钳断的注射管。
用75% 乙醇对生物膜管上的插入部位进行消毒。
将细菌悬浮液加载到每个生物膜反应器中。
钳断了污水管道。
取下针头并立即用硅胶胶封住孔。
允许在培养箱中不流动的情况下连接 2 小时。确保的内表面的生物膜反应器朝下为初始附着。
改过的生物膜反应器，使生物膜附着FAC的内表面上课起来。
启动流量（3-8 毫升/小时/通道）并取下夹子。
培养在培养箱中生物膜的收获前所需的持续时间。

生物膜处理
直接灌注
制备吨他的CaCl 2溶液在所需浓度小号在LB肉汤（0毫米，0.34毫米，和0.68毫摩尔）和负载在以一个1 -毫升注射器用26G针。
制备含有LB肉汤和对照溶液的化学矢量（H 2 ö在这种情况下）和负载在到1 -毫升注射器用26G针。
灌注前停止蠕动泵并夹住注射管。
用75% 乙醇对生物膜管上的插入部位进行消毒。
将化学溶液注入并加载到生物膜管中。
取下针头并立即用硅胶胶封住孔。
允许静电处理的所需的持续时间。
开始流动（3-8毫升/小时/信道）并取下夹具，或收获的直接生物膜。
连续加载
制备含有氯化钙的无菌介质中的一个新的瓶2 （0.68毫摩尔）和含有该载体的瓶的无菌介质的用于药物溶液（H 2 O）。
消毒封口膜和金属箔片。
停止蠕动泵并夹住进料管。
移进给管插入包含新的奶瓶Ç alcium氯化物/载体。
覆盖奶瓶用石蜡膜和金属箔。
取下夹子并启动泵；确保有系统内部无气泡。

生物膜收获
从生物膜收获的管道反应器中：
下车的流体和夹具的注射挠度和废液管小号。
就拿部分包括的注油管，油管生物膜，也浪费了系统管路进关的生物安全柜。
将生物膜管水平放置并小心取出注射和废液管s 。
让液体内容小号的生物膜管滴我n要无菌离心管中。
切生物膜从管的入口到所述出口和废料Ë出使用接种环的生物质。将所有生物质收集到上面使用的离心管中。
将每个收获样品的体积调整到相同的水平。
在室温下对收获的生物膜进行水声处理 5 分钟，以分离细菌聚集体。重新泥炭此步骤，如果大AGG regates是存在于样品英寸
涡流等分对于不同的孔定量前，样品吨通货膨胀的方法。
从生物膜收获的微流体装置/ 3通道的流动细胞
注：中号OST微流体装置被密封用二氧化硅胶，等离子体接合，和热粘合，这是不容易二sassemble生物膜收获。
下车的流体和夹具的注入和废液管小号。
移位设备小心进入生物小号afety cabiniet 。
同时取代了注射和废液管小号与短石英管不失生物膜内容小号。
允许液体含量s至滴入无菌离心管从该装置的一侧上。
将设备的另一侧连接到含有 PBS 缓冲液的注射器。
使用 buffer向前和向后清除通道。
调节每次收获的体积编样品至相同的水平。
在室温下对收获的生物膜进行水声处理 5 分钟，以分离细菌聚集体。如果样品中存在大的聚集体，则重复此步骤。
涡流等分对于不同的孔定量前，样品吨通货膨胀的方法。

生物膜观察孔定量牛逼通货膨胀
相对密度孔定量吨通货膨胀：负载100 μ升分散生物膜悬浮液到一个96孔微板具有至少5个重复对每个样品。[R EAD的OD 600使用酶标仪。相对密度代表在每个样品中形成的相对生物量。
CFU计数：制备系列稀释液（10 1 ，10 2 ，10 3 ，10 4 ，10 5和10 6 × ）分散生物膜悬浮液用LB肉汤。d ROP 10 μ升稀释的悬浮液在LB琼脂平板上具有至少5个重复的每个稀释（Herigstad等人，2001 ）。培育一个37 °C培养箱孵育16小时，随后对菌落进行计数。
注：牛逼他的方法通常旨在培养选择性与生物膜社区的特定代谢活性细菌。
流式细胞术分析（Desai等人，2019 年）：在 0.9% NaCl缓冲液中制备分散生物膜的 1 , 000 ×稀释液。按照制造商的协议计算和分析处理过的和控制的生物膜。
注：牛逼他的方法通常针对的相对孔定量牛逼细菌的通货膨胀不同的荧光标记小号。
组学研究（谈等人。，2014;丁等人。，2019 ）：分离和纯化DNA / RNA /从以下分散的生物膜悬浮蛋白质的制造商的说明书对所述分离试剂盒。
总基因组隔离：离心机1米升以8,000分散生物膜悬浮×克为3分钟，去除上清。从使用细菌沉淀分离总DNA一个DNA分离试剂盒（QIAamp的DNA微试剂盒）。
总RNA分离：我mmediately离心1米升分散生物膜悬浮液在8000 ×克为1分钟; 用NaCl仔细清洗细胞沉淀两次。隔离总RNA中的制造商的说明小号的试剂盒（RNeasy Mini试剂盒）。
注：弹簧-冻结使用液氮如果样品处理程序超过10细菌沉淀分钟。
总蛋白质分离：等分试样1米升中分散生物膜悬浮液2 -米升在微管和地点的冰-水浴中。裂解使用该细菌一个在250瓦特探头超声波仪30分钟与4 -小号间隔小号每2 -小号超声小号。离心机吨他裂解物总小号以20,000 ×克为1个ħ以收集总dissolv编蛋白的上清液。
生物膜观察和孔定量吨通货膨胀通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）。
注：Ť他生物膜反应器仅与CLSM系统兼容当其安装面是透明的并且具有厚度小于0.5毫米。
停止泵和夹具关闭两个的注入和流出物管道小号流动池的。
移整个系统中泵入CLSM设备间使用一个小车。
放置流动池到具有CLSM样品台的盖玻片面向下（仅用于反向显微镜）。
启动泵并拆下夹子。
IMAG Ë的3D结构，追踪颗粒/细菌，运动等。
图像分析方法：
软件：Imaris、Comstat2、ImageJ等。
计算：总的biovolume和每个聚合，相对fluorescen CE总和每个骨料，表面覆盖度，粗糙度，聚集体的数目，强度等。

管道的清理和再利用
从每个系统上拆下s ⑤和⑦ 部件，然后用直接头重新连接管道。
填充奶瓶用70％乙醇冲洗，并在1管道系统米升/分钟为1 ħ 。
通过将进料管中吹扫与空气管道系统的与空气的蠕动泵以最大速度工作10分钟。
重复步骤2-3 3倍。
填充奶瓶与ħ 2 ö并冲洗在1管道系统米升/分钟为1 ħ 。
通过与将所述进料管中的空气吹扫与空气管道系统的蠕动泵以最大速度工作10分钟。
重复步骤5-6 3倍。
断开系统的每个部件，干燥所有部件，然后用金属箔包裹所有部件。

数据分析

相对密度孔定量牛逼通货膨胀
原始数据（表 1）

表1演示结果为所述OD 600读数小号PAO1野生型和突变体的分散生物膜的

计算的平均值和标准偏差（表2）

表2.演示结果分析对于在OD 600读数小号PAO1野生型和突变体的分散的生物膜的

3 ．绘制结果（图 4）

图4. d EMO结果示出了PAO1野生型和突变体的分散生物膜的相对密度

CFU计数结果为分散的生物膜（图5）

图5.演示结果为分散生物膜的CFU计数

流式细胞术分析（图 6）

图6.流动的演示插图术结果为分散PAO1- GFP -标记的生物膜

生物膜的转录组学分析（图 7）

图 7.生物膜转录组学分析的演示说明：显着失调基因之间的相关性

生物膜观察和孔定量吨通货膨胀通过CLSM
S. oneidensis中MR1- GFP进行培养在一个3通道流动-细胞为7天内进行付运。观察到生物膜的形态通过CLSM上天小号3,5和7 - [R具有代表性的图像一个在图8所示重新。

图 8. S. oneidensis MR1- GFP生物膜在培养过程中的正射图像。生物膜是由开发一个薄单一小菌落的层上一天3至厚且坚固的平的生物膜上天7。

在S. oneidensis中MR1- GFP生物膜我们再次在微流体系统中培养3天四种不同的钙离子浓度。随后，通过 CLSM 成像评估每个浓度的生物膜形成，然后进行图像分析。如图 9 所示，生物膜形成与钙供应呈正相关，生物量和表面覆盖率增加。

图9 。在具有不同钙供应量的微流体装置中培养的样品生物膜的 CLSM 图像和分析。A. CLSM 成像。绿色：SYTO9染色的所有生物。乙。乙iovolume和表面覆盖物Ç从CLSM图像alculated。

基于 CLSM 成像结果的生物膜生物体积分析
打开 Imaris 并按照制造商r的说明创建一个新的“竞技场” ；创建各自的子文件夹（即，“治疗”，“控制”）。
将 CLSM 图像上传到子文件夹中。例如，将“PAO1-wild type.czi”加载到子文件夹“Control”中。”
在分析面板中，创建一个表面与一个调整的阈值。确保该表面覆盖小号米的fluorescen的OST CE信号。
Ç alculate在体积和表面覆盖安装“表面。”
导出卷信息到Ë Xcel公司。
注：È ACH片的列表中的音量信息表示小号单个菌落的计算biovolume。体积列表的总和就是图像的总体积。
基于 CLSM 成像结果的表面覆盖率和粗糙度分析
确保该的文件格式的图像与Comstat2兼容。
开始Comstat2并添加文件夹目的地上传的图像文件。
选择目标图像文件，并调整到了合适的阈值。
选择目标参数，并开始分析根据制造商的说明小号。
基于CLSM成像结果的形态观察
在 Zen 中打开 CLSM 图像。
在邻面板中，选择了具有聚焦点的最有代表性的X，Y ，和Z的景色。
调整图像的阈值。
注：牛逼他阈值必须设置为同一批次的实验相同的图像，以避免成像偏差。
生成一个新的形象的最新观点。
在新的图像面板中，添加一比例尺，并调整其前部和线大小。
在 Analyzing 面板中，选择 Export with the target file type and location ；导出正交图像。

致谢

这项工作是由广东省自然科学支持基金会杰出青年学者[2020B1515020003]和启动[Y01416206]拨款从南方科技大学（SUSTech）至LY的，和中国国家自然科学基金（31870060），以HL。该协议最初由Sternberg 和 Tolker-Nielsen ( 2006) 发布。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的经济利益。

参考

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