材料和试剂

消耗品
COSTAR ® 6孔Ç利尔TC处理的米ultiple -w ELL p酸酯（独立包装，无菌，Ç atalog号：3516）
细胞Ç ulture d ISH ，150米米（BD，Ç atalog号：353025）
2 ml微量离心管（Tarsons，目录号：500020）
1.5 ml微量离心管（Tarsons，目录号：500010）
玻璃载片（GEM显微镜载玻片，Ç atalog号：051）
盖玻片（蓝星）
的Kimwipes TM （Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号：Z671584-1EA）
10毫升小号erological p IPET TE （隼® ，Ç atalog号：357551）
无粉手套
美甲p olish
3D7菌株的镰状疟原虫（MR4）
人类b 100d的Ô + （浓缩红细胞）（旋转血库）
AlbuMAX TM II（Thermo，货号：11021037）
RPMI Media（Thermo，目录号：23400-021）

化学品和[R eagents

庆大霉素（Sigma，目录号：G1272-10ML ）
DAPI ProLong TM黄金防锈贴剂（Thermo，目录号：P36966）
山梨糖醇（Sigma，目录号：S3889-500G ）
Giemsa染色剂（Sigma，目录号：48900-1L）
DMSO Hybrimax TM （Sigma，目录号：D2650）
次黄嘌呤（Sigma，目录号：H9377 ）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：93443）
甲醇（西格玛（Sigma），目录号：34860）
DPBS或Dulbecco的改良PBS（Thermo，目录号：14190250）
牛血清白蛋白（Sigma，目录号：A7638）
葡萄糖Hybimax TM （Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号码：G5146）
钠b icarbonate / Ñ aHCO 3 （Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号：S5761）

点击Ç hemistry [R eagents

17-十八酸（Sigma，目录号：O8382）
俄勒冈绿色488 Azide（Thermo，货号：O10180）
硫酸铜/ CuSO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：451657）
盐酸三（2-羧乙基）膦/ TCEP（Sigma-Aldrich，目录号：C4706）

库存解决方案

RPMI完全培养基（1 L）（请参阅食谱）
5％山梨糖醇溶液（0.5 L）（请参阅食谱）
17-ODA储备溶液（请参阅食谱）
俄勒冈绿色488叠氮化物溶液（请参阅食谱）
TCEP解决方案（请参阅食谱）
CuSO 4解决方案（请参阅食谱）
透化缓冲液（请参见配方）
阻塞缓冲区（请参见配方）
Triton X-100 10％溶液（请参阅配方）

设备
-80 ℃下˚F reezer （热）
文化罩（Esco II类生物安全柜）
37℃我ncubator（自动CO 2培养箱）
共焦米icroscope（尼康A1）
轨道小号haker
桌面Ç entrifuge仪（Eppendorf ，型号：5180R）
摆动-铲斗转子（Eppendorf，货号：5810718007）
不锈钢-钢吨weezers（Sigma公司，目录号：T5915-1E，可以使用任何好的镊子）
Coplin j ars（Eisco L abs，目录号：BI0108PK3）

程序

原则

与c奥珀催化炔环加成叠氮化物加成（CuAAC）反应，也称为叠氮化物-炔烃Huisgen环，是一个“ ç舔ç hemistry ”反应（王等人，2003）。点击Ç hemistry是一组由高热力学驱动力驱动简单的化学反应的，其进行至完成在室温下，通常没有的副产物的形成。的CuAAC反应结合了叠氮标记的分子的炔标记分子在存在Ç奥珀（I）以产生一个1-4环加成产物经由[3 + 2]环加成反应。CuAAC是生物正交反应，这意味着没有Ë ffect的细胞内的其它化学反应或代谢物。17-ODA充当模拟内源性棕榈酸的，但它是“可点击”不像天然脂肪酸（能够经历的一个点击反应）由于一个的存在终端炔部分。

图1. CuAAC Ç之间舔反应的F luorescent记者俄勒冈格力Ñ488叠氮化物和17 Octadecynoic炔酸（17-ODA）。发生之间的反应的叠氮化物和炔moiet IES ，得到一个1-4环加成反应。

DHHC-PAT无法区分炔烃脂肪酸和天然内源脂肪酸。因此，当在生长培养基中外源供应诸如17-ODA的模拟物时，它们标记细胞内棕榈酰蛋白（Hannoush和Arenas-Ramirez，2009； Gao和Hannoush，2014； Siddiqui等人，2020）。

寄生虫培养和米etabolic标记
在3D7菌株的镰状疟原虫的培养按的改性方法Trager和Jensen的方法（Trager和Jensen，1976; Radfar等人，2009）。将培养开始与同步初期环-阶段冷冻甘油贮存有至少10％的寄生虫血症（寄生虫血症是指感染/数量寄生的红血细胞每100个红细胞）。的3D7株恶性疟原虫是O对培养+人红细胞中（来自健康献血者获得的压紧血红细胞）的完全RPMI培养基（小号EE ř ecipes），由于疟疾升寄生虫生长里面的红血细胞。通过分裂培养物并在需要时减少寄生虫病，将培养物维持在5％寄生虫血症和1-2％血细胞比容（血细胞比容是培养基中红细胞的年龄百分比（v / v））以下。通过向培养物中添加新鲜的红细胞，将血细胞比容维持在1-2％。寄生虫下培养5％ç阿尔邦氧化钛或96％的氮，3％的二氧化碳组成的气体混合物，和1％的氧。培养本实验所需要的量是小的，和一个150 -毫米细胞培养d杂交具有足够的材料以获得用于代谢标记和寄生虫Ç舔Ç hemistry。
寄生虫培养物通过山梨糖醇处理的同步，这带来的渗透裂解的的滋养体和裂殖体阶段的寄生虫，但备件的早期环状阶段。将培养悬浮液在4离心，000rpm下10分钟，使用的摆动在Eppendorf 5180R离心机-桶式转子。该p ellet与处理一个的5％的溶液小号orbitol在水中，通常在5 - 10倍过量的所述培养物沉淀量，并轻轻地再悬浮于山梨醇溶液并温育在室温下10-15分钟。此悬浮液在4离心，000rpm下10分钟，直到获得澄清溶液丢弃上清液。
优良作法是使用可点击的脂肪酸探针（17-ODA），使用山梨糖醇同步的寄生虫培养物标记该寄生虫的红细胞内发育的不同同质阶段。山梨糖醇处理的混合培养物的消除小号的晚期滋养体和裂殖体阶段，但备用小号的环阶段，ensur荷兰国际集团的寄生虫的同质群体（小号EE图2a -2 c）所示。
注：山梨醇治疗是最当培养有效含有环，滋养体的混合群，和裂殖体。见ř ecipes到MAK E中的山梨糖醇溶液。

吉姆萨染色的寄生虫涂片允许的判断同步状态的寄生虫培养之前和山梨糖醇治疗后。为了标记，将寄生虫维持在5％的寄生虫血症和1％的血细胞比容值。在寄生虫的环，滋养体，或裂殖体阶段（42-44小时后浸润或HPI）在一个6孔板中孵育补充有17-ODA，棕榈酸的可点击的替代完全RPMI培养基。最佳的17-ODA浓度需要优化。我们发现100 μM是在Optim人17-ODA的浓度即得到最好的贴标签的帧内-红细胞疟疾升寄生虫。
注意：通常，25-50的浓度μM足以用于其它细胞类型，但是在疟疾的无性阶段升寄生虫开发内部的红血细胞和可能因此需要在用于将EFFIC培养基17-ODA较高浓度ient标记。

环/滋养体/裂殖体培养物可在37°C孵育℃下在补充有17-ODA完全RMPI介质8-10ħ ，这允许蜂窝棕榈酰的代谢标记-蛋白质与17-ODA。孵育后，将培养基和寄生的红血细胞从6抽吸-孔板孔中，转移至2 -毫升微量离心管中，并在4离心，在Eppendorf台式离心机10分钟000转（参见图2e）。
注意：建议为在缺乏17-ODA的培养基中孵育的寄生虫细胞保留一个孔。涂片从这个充分的准备可以作为的特异性控制的点击反应。

涂片准备和样品固定
的感染的和未感染的红细胞是可见在微量离心管的底部作为松散颗粒（1个％血细胞比容时，总粒料体积为1 ml的堆积含有5％感染红血细胞的细胞，如果寄生虫血症为5％在100毫升培养物；每2毫升含20微升）。钍Ë上清液用移液管吸出和丢弃，并且将沉淀洗涤两次用DPBS（Dulbecco氏修饰的PBS ）。将培养沉淀轻轻地重悬于RPMI（1：1 v / v；沉淀：RPMI）；10-20微升的悬浮液用于制备涂片（小号EE图2e）。
注意：小号米尔斯还应该从在17-ODA孵育未感染的红细胞-补充的培养基观察背景信号由于荧光。

制备吨欣涂片确保š细胞的均匀分布。相应地标记载玻片以指示样品，并使其在层流生物安全罩内风干20-30分钟。超过-不推荐涂片的干燥，并且一旦干燥，涂片使用冷的甲醇中固定科普林罐10-15分钟。15分钟后取出载玻片，然后再次风干。
涂片小号是P水刺成小培养皿洗涤编三次用1 × PBS瓦特往往微不足道摇动轻轻。Ť他涂片用0.1％Triton X-100再次洗涤的PBS透化。透化，固定涂片现在准备好Ç舔Ç要执行hemistry。
原位点击Chemistr Ÿ我ñ疟疾升寄生虫细胞
所述Ç用俄勒冈绿488叠氮化物舔反应进行中的黑暗中在室温下。由于DHHC - PAT活性，用17-ODA进行代谢标记会用17-ODA标记寄生虫蛋白（Siddiqui等人，2020）。所述CuAAC Ç舔反应原因之间化学-选择性结扎化学互补叠氮化物和炔烃的功能，š因斯的脂肪酸探针（17- ODA）是硫代酯化蓟马toyl蛋白质（图2 ˚F ，反应在显示框）和炔功能可经过一个点击反应。的点击反应结合的荧光报道俄勒冈绿488叠氮化物与17-ODA的炔功能和呈现17-ODA -标记的棕榈酰蛋白荧光（图2 ˚F ）。
点击反应混合物如下制备。˚F或1个00微升反应混合物中，添加的顺序如下组分至94微升过滤的PBS ：2微升俄勒冈绿488甲zide（Invitrogen公司，最终浓度的0.1毫摩尔），2微升0.1mM的Ť RIS（2-羧乙基）膦（TCEP ）溶液，和2微升0.1mM的的CuSO 4溶液。点击反应混合物应覆盖涂片的整个表面。

图2.大号ayout的protoc的醇。（一种）。寄生虫的无性阶段被允许对人类成长b在完全RPMI培养基节100d。（b）。寄生虫文化受到ED离心。（C）。寄生虫培养沉淀物用s- bitorol处理以同步培养。（d）。使同步培养物在补充有17-ODA的完全RPMI培养基中生长。（e）。将培养物轻轻离心以获得松散的沉淀，然后将其重悬以涂片。（F）。小号米尔斯被处理并Ç舔Ç进行hemistry（框以蓝色显示了17-ODA之间的点击反应-标记的寄生虫蛋白质和俄勒冈绿488叠氮化物）。（G）。对每个寄生虫阶段进行涂片共聚焦成像，并获取原始数据。（H）。对原始数据进行处理和分析，以量化寄生虫不同无性阶段中的荧光。

注意小号：

该图像是使用BioRender创建的。
其中用于试剂的顺序的加入点击反应是至关重要的，并应在反应过程中粘附到。始终为每个实验准备新鲜的TCEP和CuSO 4并立即使用。

每个载玻片为p花边d的一个小的Petri培养皿孵育，用两个小片纸巾或棉花的浸泡在水中并排放置以保持水分，防止干燥的在孵育期间涂片。
俄勒冈绿488甲zide是fluorescen吨，应该从光被保护; 吨herefore，使反应继续进行，在40分钟的d在室温下柜。
孵育后，每个载玻片用10-15毫升过滤的PBS一个陪替氏培养皿用轻轻旋转。这被执行两次或三次，以除去任何成分的点击反应被非特异性地结合到所述涂抹/滑动表面。特别地，非特异性俄勒冈结合ģ 488叠氮化物颖到所述涂抹或滑动表面可能会导致一个高背景荧光，并且必须通过重复和温和的洗涤除去。

在滑动表面上的过量的液体应使用被吸入一个移液管，并且将剩余的水分应用擦拭的Kimwipes TM而不触及或研磨该涂抹。

幻灯片安装和固定
戴上无粉手套时接触的从这个阶段盖玻片或幻灯片前进。载玻片用DAPI ProLong TM金牌防褪色壁挂剂固定；20-30微升倒在涂片和盖玻片轻轻放置在顶部，这应轻轻放在涂片被压到避免气泡的形成。
注：建议使用镊子举行的盖玻片。盖玻片应浸泡在70％乙醇过夜，使它们无菌和污垢-免费。盖玻片往往粘在一起; 使确保只有一个盖玻片回升。

过量米ountant是GE ntly擦去用的Kimwipes滑动TM ，和吨他边的盖玻片密封到使用钉P上的滑动面olish 。钉p olish允许干燥和š大环内酯类都然后存储在所述黑暗中在4 ℃下未直到图像采集。
注：建议将图像采集进行一两天之内获得最好的结果。

数据采集与分析
任何共焦显微镜可以用于captur Ë和采集荧光的。
原始数据是使用处理的NIS图像分析软件。因为荧光由于俄勒冈绿488只叠氮化物相当于棕榈酰化蛋白质，荧光是一个直接的量度p almitoyl -转移酶活性在给定的阶段。
对于每个实验重复，建议对与每个阶段（环，滋养体和裂殖体）相对应的至少10-20个寄生细胞进行评分。需要三个实验重复的数据以获得具有标准偏差和统计显着性的平均荧光值。
Fluorescen CE为每个小区强度由绘制ROI（感兴趣区域）来确定围绕每个荧光细胞使用的NIS图像分析软件工具箱和测量fluorescen CE强度。使用开源软件ImageJ或Fiji进行这种分析也是可能的。
注：使用相同的投资回报率是非常重要，以测量电Ë的fluorescen CE强度从复制每个单元格。

Fluorescen CE用于从一个给定的阶段的细胞的强度都需要计算平均fluorescen CE强度和标准偏差。然而，需要注意的是每个重要的是细胞的fluorescen CE强度应通过减去平均背景荧光强度进行修正。
为了这个目的，一个平均背景的荧光强度是通过测量计算fluorescen CE未感染的红细胞（标有17-ODA）的强度。
校正的荧光强度通过减去平均背景确定的fluorescen CE强度的每个小区的。
注意：所述的一个verage背景荧光强度可以变化之间实验小号和复制S; 吨herefore，建议使用的背景荧光值对于给定的样品/滑动到CALCULAT Ë校正荧光数值F或细胞上的相同的滑动/涂抹。

我们计算出的平均fluorescen CE强度跨过寄生虫的无性各个阶段，发现棕榈酰化随着与寄生虫转变的环的裂殖体阶段（小号EE图3）。在恶性疟原虫的裂殖体阶段观察到最高的荧光，这表明在此阶段PAT活性最高（图3A）。

图3.后呈现荧光帧内红细胞寄生虫图像Ç舔Ç hemistry。的A.代谢标记的环，滋养体，和裂殖体阶段与17-ODA ，随后CuAAC点击Ç hemistry渲染使用俄勒冈绿488叠氮化物荧光棕榈酰化蛋白质。B.代表图像显示在寄生虫周围绘制的ROI，以测量未感染和感染的红细胞的荧光强度。

菜谱

RPMI完全培养基（1升）
测量以下成分并混合：
15.87克RPMI-1640

2克碳酸氢钠3

2克葡萄糖

5克Albumax II

0.0250克次黄嘌呤

1毫升（10毫克/毫升）克他霉素

甲DD高压灭菌或双-蒸馏水至1升
过滤除菌（0.22μm）并储存在4°C
使用前，加热至37 °C
5％（w / v）S链烷醇溶液（0.5 L）
称取25 g s轨道蛋白
添加双-蒸馏水至0.5升的最终体积
搅拌和˚F ILTER除菌（0.22μm）过滤
使用前，加热至37 °C
17-ODA储备溶液
将5 mg冻干的17-ODA粉末溶于178.57 µl DMSO中，使之在含有17-ODA的原始小瓶中的浓度为100 mM
转移到无菌1.5 - ml离心管中。在浴超声仪中超声处理2-3分钟，以有效溶解粉末。难道不牛逼了超声处理
10微升的等分试样可被存储在一个-80 ℃的˚F reezer 为长达6个月
笔记：

避免脂肪酸探针溶液的冻融循环，因为这可能对该试剂的质量产生不利影响。解冻后的等分试样不得重复使用或重新冷冻。准备用于标记细胞的新鲜17-ODA总是好的。
添加所述的17-ODA库存合适体积的预热完全RPMI培养基中，以37℃。允许1-2小时为与血清白蛋白预复合。
俄勒冈绿色488叠氮化物溶液
溶解0.5毫克俄勒冈绿488一个在156.8微升DMSO zide（至最终浓度的5在1.5毫米）- ml离心管
超声处理5分钟，将溶液分成等分试样（每管10μl）并在-80°C下储存
俄勒冈绿488一个zide是光敏感的和应避光保存。避免冻融其库存
TCEP解决方案
TCEP始终准备新鲜并立即使用

溶解7.2毫克TCEP在0.5ml的Milli-Q水纯化（至终浓度的在50mM）1.5 - ml离心管
涡旋混合以溶解TCEP
硫酸铜4小号olution
CuSO 4始终准备新鲜并立即使用

溶解79.8毫克的CuSO 4在10ml的Milli-Q水纯化（至终浓度的在15的50mM）-毫升锥形离心管
涡旋混合以溶解CuSO 4
通透缓冲液
加入10毫升10％（V / V）的Triton X-100（于最终浓度的0.1％（V / V））到990毫升的PBS
用搅拌棒搅拌溶液以溶解Triton X-100
使用pH计验证pH（7.2±0.1）
缓冲器应通过0.2被过滤μ微米的过滤器和能够在室温下储存长达2个月
阻塞缓冲区
25克BSA添加（到最终浓度的5％（W / V））和15毫升10％（V / V）的Triton X-100（于最终浓度的0.3％（V / V））485毫升的PBS
用搅拌棒搅拌溶液以溶解BSA和Triton X-100。避免起泡
pH应为7.2。每次都准备新鲜
Triton X-100 10％溶液
将10 ml Triton X-100加入90 ml PBS（1 × ）中，轻轻搅拌直至获得均质溶液。使用宽-从瓶子孔尖端吸液的Triton X-100

确认小号

作者谨感谢印度政府CSIR的研究金支持。还要感谢扶轮血库provi丁的Ò + b节100d用于培养疟疾升寄生虫到了在遗传工程中心共焦设施。该协议被修改用于标记疟疾升由所述的原始协议寄生虫在高，X。和Hannoush，RN（2014）。脂肪酰化蛋白质中棕榈酰化的单细胞原位成像。Nat Protoc 9（11）：2607-2623。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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Hannoush，RN和Arenas-Ramirez，N.（2009年）。脂质组成像：ω-炔基脂肪酸，用于脂质修饰的蛋白的检测和细胞可视化。ACS Chem Biol 4（7）：581-587。
Gao X.和Hannoush，RN（2014）。脂肪酰化蛋白质中棕榈酰化的单细胞原位成像。Nat Protoc 9（11）：2607-2623。
Wang，Q.，Chan，TR，Hilgraf，R.，Fokin，VV，Sharpless，KB and Finn，MG（2003）。铜（I）催化的叠氮化物-炔烃[3 + 2]环加成反应的生物共轭作用。J Am Chem Soc 125（11）：3192-3193。
Siddiqui，MA，Singh，S.，Malhotra，P.和Chitnis，CE（2020）。蛋白S-棕榈响应外部信号，并发挥在微线体分泌调节作用P lasmodium恶性疟原虫裂殖子。ACS感染Dis 6（3）：379-392。
Trager，W。和Jensen，JB（1976）。连续培养中的人类疟疾寄生虫。科学193（4254）：673-675。
Radfar，A.，我Ñ费尔南德斯，D.，Moneriz，C.，利纳雷斯，M.，马林加西亚，P.，Puyet，A.，迭，A。和Bautista的，JM（2009）。恶性疟原虫高寄生虫水平的同步培养。Nat Protoc 4（12）：1899-1915。