材料和试剂

1.黑色的384孔板（Corning，384 –孔低法兰黑色平底NBS，货号：3575）
2. Pippette提示移液站（CyBio ，SELMA25分之384μ升移液管尖端（标准），目录号：OL3800-25-513-N）
3.平板密封胶带（Bio- R ad，光学密封胶带，目录号：2239444）
4. 384孔复合储物板（Nunc，目录号：269390）
5. PD-10柱（GE Healthcare，目录号：52130800）
6. 15米升离心管（星实验室，目录编号：E1415-0200）
7.储气库（Thermo Scientific，目录号：8096-11）
8.固定的TCEP琼脂糖（Pierce，目录号：77712）。储存于4 °C（保质期〜1个月，可添加可溶性TCEP至终浓度50 µM以延长保质期）
9. CPM：7-二乙基氨基-3-（4'- maleimidylphenyl）-4-甲基香豆素（赛默飞，目录号：D346）。储存于0.5mM的在DMSO中于-20在56μ的等份℃的升
10.还原的L-谷胱甘肽（Sigma-Aldrich，目录号：G4251）。储存在4 °C
11.靶蛋白-包含单个表面暴露/反应性的半胱氨酸残基（根据需要通过标准分子生物学方法进行克隆和表达）。请参阅注释1 f或兼容性注意事项
12.对照蛋白-它的序列应与靶蛋白相同，但应去除反应性半胱氨酸（根据需要通过标准分子生物学方法进行克隆和表达）。通常，反应性半胱氨酸突变为丙氨酸或丝氨酸
13.共价片段文库（化合物储存在50mM的DMSO中在384孔化合物板存储，每板320化合物中的列3 - 22，将列1，2，23和24是空白的）。有关组成和存储注意事项，请参阅第2页
14.碘乙酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：I1149）
15. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
16.氯化钠（西格玛奥德里奇，目录号：S7653）
17. （可选）氩气（BOC，目录号：11Y）
18. DMSO（西格玛奥德里奇，目录号：D8418）
19.反应缓冲液（请参见配方）
20.淬火buffe - [R （见配方）
21. CPM淬灭解决方案（请参阅食谱）
22. 3倍TCEP琼脂糖库存（1.5％悬浮液）（请参阅食谱）
23. 3倍GSH储备液（15 µM）（请参阅食谱）
24. 3x目标蛋白储备液（15 µM）（请参阅食谱）
25. 3x对照蛋白储备液（15 µM）（请参阅食谱）

设备

Ť IME R（实验室异动，目录号：HS24670）
单通道移液器（Gilson）
12通道移液器（Sartorius，Picus电子10-300 µl，目录号：735461）
酶标仪（BMG LABTECH，型号：CLARIOstar ）
半自动移液站（Analytik J ena，型号：CyBio SELMA 384/25 µl）
带平板适配器的离心机（Ependorf ，型号：5804 R）
NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific，目录号：ND-2000）

软件

Microsoft Excel
GraphPad棱镜8

程序

评估蛋白质构建体相容性和健壮性的试验分析
组装反应板（布局见表1）。

表1.初步试验的反应板布局

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B =缓冲区；G = GSH；TP =目标蛋白；CP =对照蛋白；D = DMSO；IA =碘乙酰胺

钽磕一个黑色384孔板和其标记为“反应板”
用12道移液器将20 µl新鲜制备的3 x TCEP ag玫瑰色储备液从试剂容器中分配到反应板的每个孔中。在移液过程中，需要定期搅动珠子，以保持均匀的悬浮液，应切掉移液器吸头的底部以防止其阻塞。
使用12道移液器将20 µl反应缓冲液从试剂容器中分配到反应板的第1、5、9、13、17和21列中。
使用12道移液器从试剂储器中将20 µl 3x GSH储备液分配到反应板的第2、6、10、14、18和22列中。
使用12道移液器将20 µl 3x目标蛋白储备液从试剂储器中分配到反应板的第3、7、11、15、19和23列中。
使用12道移液器将20 µl 3x对照蛋白储备液从试剂储库中分配到第4、8、12、16、20和24列中，进入反应p 。
在室温（RT）下孵育2小时，以确保TCEP琼脂糖完全还原半胱氨酸残基。
启动碘乙酰胺和DMSO控制反应。
分配20微升反应缓冲液含有3％DMSO为，，，，，，19列1 2，3 4 9 10 11，12 17，18和反作用板20从一个REA绅士储使用12通道移液器。
使用12道移液器将20 µl 1.5 mM碘乙酰胺溶于含有3％DMSO的反应缓冲液中，从试剂容器中注入第5、6、7、8、13、14、15、16、21、22、23和24列中。
使用384孔半自动移液站吸取并分配25 µl三次，以混合所有孔（有关如何操作移液站的详细信息，请参阅www.analytik-jena.com/products/liquid-handling-automation/灵活的台式自动化/ cybio-selma /）。
启动一个计时器。
将板以200 x g离心3分钟以沉淀TCEP琼脂糖。
执行第一个CPM淬火（Q1）。
取一个新的黑色384孔板并将其标记为“淬灭板Q1” 。
准备20毫升新鲜的CPM淬灭溶液（请参阅食谱）。
将27 µl CPM淬灭溶液分配到淬灭板Q1的每个孔中。
使用384孔半自动移液站，从反应板每个孔的顶部吸出3 µl溶液，然后分配到淬灭板Q1中（从顶部吸出，确保不转移TCEP琼脂糖）。
通过抽吸和分配25 µl三遍来混合淬灭板的所有孔。
记录在时间的计时器（这应为5和15分钟之间）。
用板密封带密封反应板以防止蒸发，并在室温下保存直至下一次淬灭。
在室温下孵育淬灭板Q1 1小时。
测量淬灭板Q1的荧光强度（激发/发射：384/470 nm）。
当计时器为1 h时，通过重复Ste p A3进行第二次CPM淬灭（Q2）。
当计时器为5小时时，通过重复步骤A3进行第三次CPM淬灭（Q3）。
当计时器为24小时时，通过重复步骤A3进行第四次CPM淬灭（Q4）。
完成最终测量后，将数据导出到Microsoft Excel中进行数据处理。

共价片段筛选的320个化合物- DS（小号EE图1为示意性的工作流程）

图1.通过qIT筛选共价片段的示意性工作流程

组装蛋白质反应板。
取一块黑色的384孔板并将其标记为“蛋白反应板” 。
用12道移液器将20 µl新鲜制备的3 x TCEP琼脂糖原液从试剂储器中分配到蛋白质反应板的每个孔中。在移液过程中，需要定期搅动珠子，以保持均匀的悬浮液，应切掉移液器吸头的底部以防止其阻塞。
使用12道移液器将20 µl 3x对照蛋白原液从试剂容器中分配到蛋白反应板的第1列和第2列中。
分配20微升3倍的靶蛋白的库存为列3 -从所述蛋白质反应板的24使用12通道移液器试剂贮存。
在室温下孵育2小时，以确保TCEP琼脂糖完全还原半胱氨酸残基。
组装GSH反应板。
取一个新的黑色384孔板并将其标记为“ GSH反应板” 。
用12道移液器将20 µl新鲜制备的3 x TCEP琼脂糖原液从试剂储器中分配到蛋白质反应板的每个孔中。在移液过程中，需要定期搅拌储液罐中的珠子以保持均匀的悬浮液，并且应切掉移液器吸头的底部以防止其阻塞。
使用12通道移液器将20 µl反应缓冲液从试剂储罐中分配到GSH反应板的第1和第2列中。
使用12道移液器将20 µl 3x GSH储备液从试剂容器中分配到GSH反应板的3-24列中。
在室温下孵育2小时，以确保TCEP琼脂糖完全还原GSH。
组装3x复合原料板。
取一个新的黑色384孔板并将其标记为“ 3x复合板” 。
使用12道移液器将58.2 µl反应缓冲液从试剂容器中分配到3x化合物板的所有孔中。
使用半自动移液站将1.8 µl DMSO分配到3x复合板的1、2、23和24列中。
使用半自动化移液位置抽吸1.8μ升从每个孔中的共价片段文库存储板（化合物是在列3 - 22，将列1，2，23和24是空白）和分配到3X化合物板。
通过吸取并分配25 µl三遍来混合3x复合板的所有孔。
将3x复合板以200 xg离心3分钟以沉淀出任何沉淀物。
密封并存储共价片段库存储板。
启动蛋白质反应（有关最终布局，请参见表2）。

表2.用于共价片段筛选的蛋白质反应板布局

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TP + D
TP + D
TP =目标蛋白；CP =对照蛋白；D = DMSO；F =共价片段

从3x复合板的每个孔中吸出20 µl ，并使用半自动移液站分配到蛋白质反应板中。
通过吸取并分配25 µl三遍来混合蛋白质反应板的所有孔。
启动一个计时器（蛋白质反应计时器）。
将蛋白反应板以200 xg离心3分钟以沉淀TCEP琼脂糖。
启动GSH反应。
吸20μ升从每个孔理论值的ë 3X化合物板和分配到使用GSH反应板半自动化移液位置。
通过抽吸和分配25 µl三遍来混合GSH反应板的所有孔。
启动一个计时器（GSH反应计时器）。
将GSH反应板以200 xg离心3分钟以沉淀TCEP琼脂糖。
进行第一个蛋白质CPM淬灭（PQ1）和GSH CPM淬灭（GQ1）。
取两个新的黑色384孔板，并标记一个“蛋白质淬灭板PQ1”和另一个“ GSH淬灭板GQ1” 。
制备20米升的新鲜CPM骤冷溶液（S EE食谱）。
将27 µl CPM淬灭溶液分配到淬灭板PQ1和GQ1的每个孔中。
使用384孔半自动移液站，从蛋白质反应板每个孔的顶部抽吸3 µl ，然后分配到淬灭板PQ1中。
通过吸取并分配25 µl三次来混合PQ1的所有孔。
记录在蛋白质计时器的时间（这应该是5和15分钟之间）。
用板密封带密封蛋白质反应板，以防止蒸发并在室温下保存直至下一次淬灭。
使用384孔半自动移液站，从GSH反应板的每个孔的顶部抽吸3 µl ，然后分配到淬灭板GQ1中。
通过吸取并分配25 µl三遍来混合GQ1板的所有孔。
在GSH计时器上记录时间（该时间应该在5到15分钟之间）。
用板密封带将GSH反应板密封，以防止蒸发并在室温下保存直至下一次淬灭。
在室温下孵育淬灭板PQ1和GQ1 1 h。
测量Q1淬灭板的荧光强度（激发/发射：384/470 nm）。
当计时器为0.5小时，1小时，2小时，4小时，6小时，18小时，22小时和26小时时，重复步骤B6 ，执行后续的CPM淬灭（Q2 - Q9）。
完成最终测量后，将数据导出到Microsoft Excel中进行数据处理。

数据分析

分析中试分析以评估蛋白质构建体的相容性和耐用性
Q1淬火分析
在Microsoft Excel中，计算“缓冲液+ DMSO”（第1、9和17列），“缓冲液+碘乙酰胺”（第5、13和21列），“ GSH + DMSO”（各列）的荧光强度的平均值和标准偏差2、10、18 ），“ GSH +碘乙酰胺”（第6、14和22栏），“目标蛋白+ DMSO”（第3、11和19栏），“目标蛋白+碘乙酰胺”（第7、15栏）和23），“对照蛋白+ DMSO”（第4、12和20栏）和“对照蛋白+碘乙酰胺”（第8、16和24栏）。
计算Z因子：Z = 1 - （3-（σ P + σ N）/ |μP - μN|（σ p值=标准偏差阳性，σ N =阴性的标准偏差，μP=平均阳性，μN=下列组合的负数平均值）：
正= “ GSH + DMSO”；负=“缓冲区+ DMSO”
正= “ GSH + DMSO”；阴性=“ GSH +碘乙酰胺”
阳性= “目标蛋白+ DMSO”；阴性=“对照蛋白+ DMSO”
阳性= “目标蛋白+ DMSO”；阴性=“目标蛋白+碘乙酰胺”
要检查的边缘效应，确认该列1给出了一个类似的平均荧光强度，以列9和17和该列24给出了类似的平均荧光强度，以列8和16见Ñ OTE 3如果观察到边缘效应。
对Q2，Q3和Q4重复上述Z因子分析。

中试测定结果的解释。
通常，用于小分子筛选的Z因子> 0.5意味着该测定被认为适合筛选（Zhang等，1999 ）。因为该测定法是时间依赖性的，所以我们采用以下标准。
对于所有淬灭，Z因子（正=“ GSH + DMSO”；负=“ Buffer + DMSO”）应> 0.5，动态范围≥5 。我们经常看到此Z因子随着时间的推移略有下降，但在我们的实验室通常在第四季度> 0.6。如果随时间推移观察到动态范围和Z因子急剧下降，则表明TCEP-琼脂糖珠可能已被氧化，需要更换。
Z因子（正=“ GSH + DMSO”；负=“ GSH +碘乙酰胺”）应随时间增加，并且对于Q3和Q4而言> 0.5。
对于所有淬灭，Z因子（阳性=“目标蛋白+ DMSO”；阴性=“对照蛋白+ DMSO”）应> 0.5，动态范围≥10 。这表明目标蛋白上的目标半胱氨酸正在反应CPM成功。
还应将“对照蛋白+ DMSO”的平均荧光强度与“缓冲液+ DMSO”进行比较。在此，典型的最大动态范围是2 。但是，如果它实质上大于2 ，这可能表明构建体上还有其他与CPM反应的半胱氨酸。如果是这种情况，应重新评估构建体（请参阅“注释1” ），并可能需要其他半胱氨酸突变。
Z因子（正=“目标蛋白+ DMSO”；负=“目标蛋白+碘乙酰胺”）应随时间增加，并且对于Q3和Q4而言> 0.5。

共价片段筛选
诺马丽泽的荧光强度值在Microsoft Excel PQ1（见燮p文件中号entary Excel工作表对于包括模拟数据的模板）。
计算“对照蛋白+ DMSO”的平均荧光强度（第1列和第2列）。
计算“目标蛋白+ DMSO”的平均荧光强度（第23和24列）。
从“目标蛋白+ DMSO”的平均荧光强度中减去“对照蛋白+ DMSO”的平均荧光强度，得出“基线最大信号”。
从每个反应孔（列3的荧光强度减去“控制蛋白质+ DMSO”的平均荧光强度- 22），得到一个“基线荧光强度”为每个反应。
将320个“基线荧光强度”值除以“基线最大信号”值，得出时间（淬灭）= Q1时每个反应的“归一化荧光强度”。
像上面对PQ1一样标准化PQ2-9的荧光强度值。
在GraphPad Prism中创建一个标题为“蛋白质动力学”的XY数据表，其中每个共价片段的时间（淬灭时间）以分钟为单位= X，归一化荧光强度=Y。
插入：新分析：非线性回归（曲线拟合）：一相衰减，具有以下约束：0> Y0> 0.2; 高原> 0.8。
插入：现有数据集的新图：选择为每个数据集创建新图。
检查每个反应的R平方值，并突出显示任何低的值。请注意，在反应非常缓慢或快速的情况下，R平方值将很低，在这种情况下，不应将所观察到的速率常数取为表面值。手动检查每个图形的异常值。有时，单个淬火之一可能会在整个板上出现异常值，应将其排除在外。
将每个反应的K值复制到新的Microsoft Excel表中，该表名为“ k obs target protein”列下的“ REF Analysis ”。
在Microsoft Excel中归一化GQ1的荧光强度值
计算“ Buffer + DMSO”的平均荧光强度（第1列和第2列）。
计算“ GSH + DMSO”的平均荧光强度（第23和24列）。
从“ GSH + DMSO”的平均荧光强度中减去“ Buffer + DMSO”的平均荧光强度，得出“基线最大信号”。
从每个反应孔（列3的荧光强度减去“缓冲液+ DMSO”的平均荧光强度- 22），得到一个“基线荧光强度”为每个反应。
将320个“基线荧光强度”值除以“基线最大信号”值，得出时间（淬灭）= Q1时每个反应的“归一化荧光强度”。
像上面对GQ1一样标准化GQ2-9的荧光强度值。
在GraphPad Prism中创建一个名为“ GSH动力学”的XY数据表，其中每个共价片段的时间（淬灭时间）以分钟为单位= X，归一化荧光强度=Y。
插入：新分析：非线性回归（曲线拟合）：一相衰减，具有以下约束：0> Y0> 0.2; 高原> 0.8。
插入：现有数据集的新图：选择为每个数据集创建新图。
检查每个反应的R平方值，并记下任何低值。手动检查每个图形的异常值。
将每个GSH反应的K值复制到标题为“ k obs GSH”列下的Microsoft Excel表“ REF Analysis ”中。
将k obs目标蛋白色谱柱除以k obs GSH色谱柱可为每个反应生成REF。
计算几何平均值和标准开发的的iation个REF。
命中片段可以定义为那些REF相对于几何平均值有3个标准偏差的片段，或者可以由REF排序并定义任意命中率（例如，最高2％）。在Prism中的蛋白质和GSH反应曲线然后应人工检查所有命中化合物，以确认该曲线拟合和数据质量是合适的。
从主要共价片段筛选中进行跟进：来自初筛的所有命中化合物均应按照相同方案一式三份进行重新筛选，以确认可重复性和可靠的定量命中排名。我吨还可能有利的是在rescreen多个浓度（命中例如，500，250，100和50μM），以获得进一步的见解到修改的浓度依赖性。然后在可能的情况下，应通过质谱分析，生化分析和/或X射线晶体学来正交验证命中。有关如何进行跟踪的示例，请参见我们最近在qIT上发表的文章（Craven等，2020）。

笔记

如有可能，应分析靶蛋白的结构，以鉴定可能暴露于溶剂的任何半胱氨酸残基。在情况š其中目标具有多于一个暴露于溶剂的半胱氨酸残基，位点定向诱变，应适用于生成包含仅表面上的目标半胱氨酸残基的构建体。点突变会影响靶蛋白的结构或生化活性，应将新构建体与野生型进行比较，以确认未发生这种情况。纯化标签也应无半胱氨酸残基或被切掉。我们通常建议在蛋白质纯化和存储缓冲液中加入还原剂（例如DTT）。但是，这些还原剂必须在测定开始之前完全除去，这可以通过使用PD-10色谱柱进行缓冲液交换来轻松实现。
半胱氨酸靶向的共价片段的商业供应商包括Enamine ，LifeChemicals和Cominnex 。还可以找到对共价片段文库设计的考虑的综述（Keeley等，2020 ）。共价片段库应接受持续的质量控制。储存在D 6 -DMS O中可以通过NMR定期评估纯度和降解。如果可能的话，应该DMSO股的冻融循环被避免，尽量减少引入大气中的水。
边缘效应通常是由整个板上的蒸发或温度差异引起的。我们在该协议中没有观察到任何边缘效应。乙UT如果他们观察到，那么应注意尽量减少不使用时，请小心地通过密封板蒸发，以确保所有组件均保持在室温下。如果仍然观察到边缘效应，则可以重新设计板布局，以排除使用板的外部孔。

菜谱

反应缓冲液
2 5 mM HEPES（pH 8.0）
150毫米氯化钠
淬火缓冲液
25 mM HEPES（pH 7.5）
150毫米氯化钠
笔记：
甲如果需要通过对稳定性例如盐和甘油靶蛋白dditional缓冲成分可以被添加到任何反应缓冲液和/或淬灭缓冲液。然而，诸如DTT可溶性还原剂，β ME或TCEP必须不被加入，因为它们会与CPM反应。应始终测试添加的任何新缓冲液成分（尤其是去污剂）与CPM的兼容性。
（可选的）如果蛋白质对需氧氧化高度敏感，则在使用前应通过将氩气鼓泡30分钟使缓冲液脱气。
CPM淬火解决方案
要制备20 ml的1.39 µM CPM淬灭溶液，请将DMSO中的55.6 µl的0.5 mM CPM加入20 ml的淬灭缓冲液中。在稀释到淬灭缓冲液中之前，应立即融化56 µl DMSO中0.5 mM CPM的等分试样，并应在准备15分钟后进行淬灭。CPM在室温下在水中的稳定性很低，并且通过遵循这种做法可以最大限度地提高检测性能
3 x TCEP琼脂糖储备液（1.5％悬浮液）
吸移管300μ升ö ˚F固定的TCEP一个garose（存储为50％的悬浮液）成15ml离心管中并稀释至15ml用反应缓冲液
通过手动反转混合
以600 x g离心1分钟以沉淀珠粒
吸出并丢弃上清液
再重复4次稀释，混合，离心和抽吸步骤
稀至10μm升用反应缓冲液
3 x GSH库存（15 µM）
使用前立即准备新鲜
在10 ml反应缓冲液中溶解46 mg还原型谷胱甘肽，得到15 mM储备液
添加15μ升的15 mM储备的成15米升反应缓冲液，得到15μM股票
3 x目标蛋白质储备液（15 µM）
使用PD-10色谱柱将目标蛋白缓冲液交换到反应缓冲液中
通过NanoDrop确定蛋白质浓度，并在反应缓冲液中稀释至15 µM
离心2 ，400 X克5分钟以除去沉淀物
3 x对照蛋白储备液（15 µM）
使用PD-10色谱柱将目标蛋白的半胱氨酸敲除类似物缓冲液交换到反应缓冲液中
通过NanoDrop确定蛋白质浓度，并在反应缓冲液中稀释至15 µM
离心2 ，400 X克5分钟以除去沉淀物

致谢

这项工作得到了补助金由化学生物学研究所（伦敦帝国学院），英国工程和物理科学研究理事会（助学金奖EP / F500416 / 1 ）和癌症疫苗和小儿麻痹症研究基金。此处描述的协议改编自先前的出版物（Craven等人，2018 ）。

利益争夺

GBC，AA，和DJM共-上的专利申请发明者覆盖QIT ：PCT / GB2017 / 052456 。

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