设备

Mac-Pro（mi-2010），2 x 3.46 GHz，2 x 6核Intel Xeon，96 Go 1333 MHz DDR3 RAM，SSD 1 To，3 x 6 To Sata磁盘，2 x NVIDIA Quadro K5000图形卡，macOS版本10.13.6（Apple Inc.）
笔记：

一种。使用当前配置，可以在不到10分钟的时间内完成微管晶格参数的确定和3D重建的计算。

b。由于ImageJ是多平台的，因此TubuleJ插件可以在任何装有兼容操作系统（MacO ，Linux，Windows）的计算机上安装和运行。TubuleJ需要并行处理（快速傅立叶变换具有平行FFTJ，3D重建与优点TomoJ ）。因此，辑阵-core处理器将加速计算。根据您的配置为ImageJ分配足够的RAM，并确保它使用并行处理（“编辑->选项->内存和线程…”）。

软件

ImageJ软件：https : //imagej.nih.gov/ij/
TubuleJ插件到ImageJ：https : //igdr.univ-rennes1.fr/TubuleJ/
FFTJ（在TubuleJ中实现）：https : //sites.google.com/site/piotrwendykier/software/parallelfftj
并行FFTJ是ImageJ的多线程快速傅立叶变换插件。

TomoJ （在TubuleJ中实现）：https : //sourceforge.net/projects/tomoj/
TomoJ允许在执行3D重建之前对倾斜序列进行预处理和配准。

加州大学旧金山分校Chimera：https : //www.cgl.ucsf.edu/chimera/

程序

TubuleJ安装
从https://igdr.univ-rennes1.fr/TubuleJ/下载TubuleJ和测试图像。
解压缩TubuleJ.zip并将TubuleJ文件夹安装在ImageJ的插件文件夹中。

微管选择
打开电子显微镜伊马GE以lm ageJ。
选择“插件-> TubuleJ- > TubuleJ ” 。TubuleJ的界面打开（图1A）。
单击“选择光纤”，然后创建一个名为“ MTa ”的文件夹。选择此文件夹作为您的工作目录。
注意：单个图像中经常会出现多个微管，这需要为每个要分析的微管创建一个单独的文件夹。

将像素大小固定为2.16Å（图2A），然后按“确定”。
注意：如果存在像素大小，则会自动从标题中恢复像素大小。如果不存在或不正确，则必须在此阶段进行设置。在当前情况下，图像标题为2.21Å，但是实际放大倍数是使用烟草花叶病毒校准的，该像素的像素大小为2.16Å。如果要分析微管蛋白的紧实状态（Hyman等，1995），由于亚基单体重复序列的变化约为几埃，因此在工作放大倍数下精确校准图像非常重要。

在目标光纤上画一条线（图2B），然后按“确定”。这定义了图像的旋转角度。
在感兴趣的光纤周围画一个方框（图2C），然后按“确定”。呈现了一个名为“ image_orig.tif ”的图像（图2D）。选择整个图像（“编辑”->“全选”），然后将图像调整为例如189的高度，以最小化背景（图像->裁剪；图2E）。将此图像保存在工作目录中。
笔记：

一种。视频1中提供了从微管选择（B）到3D重建（I）的过程。

b。由于插件从在ImageJ中打开的当前图像开始，因此TubuleJ可以使用在ImageJ中可以打开的任何文件格式。它包括tiff等经典格式。通过安装TomoJ，也可以接受专用于电子显微镜的格式，例如dm3，mrc，spider或mrc.bz2。

图2.微管选择。A.像素大小设置。B.微管图像的旋转。C.微管图像拳击。D.提取区域。E.裁剪提取区域以使背景最小化。

视频1.微管图像分析和3D重建

微管矫直
选择“ image_orig.tif ”，然后单击“ Untwist fiber”。设置以下参数（图3A）：'输入子图像的宽度（像素）：384'; '输入步长（像素）：192'; “输入直纤维图像的高度（像素）：185”。让我们检查“正确的对比度”；“半径：60”，请取消选中“显示中间台阶图像”，然后按“确定”。在日志窗口中指示了微管子区域相对于水平的方向。呈现了针对对比度变化进行校正的提取图像（图3B），以及从左侧开始的第一个子区域（水平方向大致对齐）（图3C）以及微管子区域傅里叶变换的赤道的线轮廓（图3D））。
笔记：

一种。子区域的宽度将取决于像素大小和图像中存在的信噪比。我们通常在标本级别使用50至100 nm之间的子图像长度。步长可以设置为宽度的一半，而直纤维的高度大约比微管图像的宽度（像素）大65％。对宽度尺寸使用奇数值，以使微管图像正确居中。注意：灰色渐变主要是由于冰厚度的变化，例如，从碳孔的边界到中心。为了正确过滤微管图像，必须对其进行校正。'radius'选项对应于ImageJ中的高斯滤波器的值，该值用于生成从原始图像中减去的背景图像。

b。选项“显示中间步骤图像”显示所有摘录（名为“水平和居中窗口”的图像），以及显示用黑线连接的局部中心（白叉）的图像。这些图像的分析可能有助于确定为什么在局部确定微管中心时算法失败。

单击从左侧开始的第二个大峰值的水平（频率约为10，图3D）。可以在日志窗口中跟踪本地中心计算的进度。呈现了针对对比度变化进行校正的矫正图像，称为“ image_orig -straight”（图3E）。
笔记：

一种。TubuleJ使用J 0贝塞尔函数的相位来使微管图像居中（Blestel等，2009），其对应于图3D中的3-4个第一大峰。较高分辨率的峰可能与J N重叠（N =原生丝数，此处N = 15）。选择频率在〜10处的第二个大峰值限制了J N项的贡献，这可能会破坏对中过程。

b。由于点中心是从第一个子区域的中间到最后一个子区域的中心，因此拉直后的图像比原始图像短。TubuleJ手册中提供了使整个图像变直的过程。此过程使用此协议中未描述的“从文件中解绕光纤”例程。此例程也可用于调整偏心点。

图3.微管矫直。A.矫直参数。B.对比校正图像。C.从左边开始的第一个子区域。D.微管子区域傅里叶变换的赤道的线轮廓。十字放置在J 0 Bessel项的第二个大峰值的水平（红色箭头）。E.拉直的微管图像。

微管对中
选择“ image_orig -straight”，然后单击“ Center Straight Fiber”，将FFT的最大宽度设置为2048像素（图4A），然后按“ OK”。图像的傅里叶变换（未显示）与微管图像FFT的赤道上的轮廓一起显示（图4B）。
单击从左边开始的第三个大峰值的水平（频率大约为55）。出现了一个名为“ image_orig -straight-Centered”的图像（图4C），并且在日志窗口中指示了沿“ Y轴”的平移。如果未裁剪' image_orig -straight'图像，则它应最小（小于1像素）。
笔记：

一种。当原丝相对于微管的纵轴倾斜时，赤道的剖面图应仅由J 0组成，而没有J N的贡献（请参见图5A-5 B和6A中的功率谱）。因此，以比校正过程中更高的分辨率单击峰是安全的。

b。我们已经限制了傅里叶变换大小至4 ，096×4 ，096像素，因为中心的过程是计算密集型的。此过程可能需要一段时间，请等到完成为止。

图4.微管居中。A.设置FFT大小。B.经拉直的微管图像的傅立叶变换的赤道的线轮廓。十字放置在J 0 Bessel项的第三个大峰值的水平（红色箭头）。C.居中图像。

确定原丝的手感和沿原丝重复的微管蛋白亚基
选择“ image_orig -straight-Centered”，然后单击“ Analyze FFT”。呈现图像的傅立叶变换以及与功率谱交叉的水平线。选择FFT窗口并放大，直到衍射图样填满图像。调整对比度以强调图层线条图案（例如，在B＆C窗口中，从0到〜3.0E13）。
移动黄线越过J S层线（图5A），然后按“确定”。
移动黄线越过J N-S层线（图5B），然后按“确定”。的线剖面Ĵ小号和Ĵ N-S被呈现（图小号5C- 5 d）。
在“分析FFT参数”窗口（图5E）中，设置默认值（“以Å为单位的近似大小：40.0”和“以Å为单位的搜索范围：10”），然后按“确定”。这设置了在FFT中搜索峰值的间隔。将打开一个窗口，询问您是否要关闭中间窗口。按“确定”。结果显示在对数窗口中：“单体重复”为40.87Å，原丝偏斜角“θ”为正。这些值将用于确定原丝偏斜角（G）并构建适合3D重建（H）的图像堆栈。
笔记：

一种。螺旋光纤的傅立叶变换的特征在于与该光纤中存在的不同螺旋族相对应的层线。这些层线在数学上由Bessel函数描述。在微管的情况下，阶数为“ 0”（J0）的贝塞尔函数是由于微管的管状性质所致。它位于傅立叶变换的“赤道”上，用于精确地使微管图像居中（有关详细信息，请参阅Blestel等，2009）。“ N”阶（JN）的贝塞尔函数来自微管蛋白分子沿N个原丝的线性排列。由于原丝大致平行于微管纵向轴线，JN位置靠近J0（图URE 5A）。“ S”阶的贝塞尔函数是由于微管晶格周围的微管蛋白单体之间的横向相互作用。此螺旋的一整圈包括高度为S的单体（在大多数微管类型中，S = 2至S = 4）。JS位置靠近所述傅里叶微管的图像的变换“子午线”（图URE 5A，经络垂直于赤道）。阶“ N-S”的贝塞尔函数在几何上与JN和JS有关。JN-S从子午线比JS（图更远是URE 5A）。

b。原丝偏斜角符号的确定基于以下规则（Chrétien等，1996）：当J S比J N-S距赤道更远时，θ为负，当J S比J距赤道更近时。NS ，θ是正的。

图5.微管傅里叶变换的分析。A.选择J S层线。指示了主层线。J 0位于傅立叶变换的赤道上。J S比J N-S更靠近赤道，表明微管具有右手的原丝。B.选择J N-S层线。C.沿J S的线轮廓。D.沿J N-S的线轮廓。E.峰值搜索间隔。

微管图像过滤和微管极性的确定
选择“ image_orig-straight_Centered ”，然后单击“滤光纤维”。
选择FFT窗口（图6A）并放大直到衍射图填充图像。
选择ImageJ的矩形工具，并在赤道的每一侧绘制一个包含J 0和J N项的第一个峰的矩形，然后按“确定”。
输入21行，然后按“确定”。单击“是”接受所选区域，然后在“是否要选择其他图层线？”窗口中回答“否”。呈现了一个名为“过滤后的图像”的图像（图6B），该图像强调了莫尔图案，该莫尔图案源自投影中成像的歪斜原丝。
波纹图案具有指向图像左侧的“箭头”形状。由于原丝是右手的（θ为正），因此微管的正端指向左侧。
注意：箭头图案是由于沿微管轴观察时微管蛋白的不对称形状引起的（请参见图9D和10）。当原丝具有相反的手性时，这种模式的方向性相反（Chrétien等，1996； Sosa和Chrétien，1998）。确定微管极性的规则如下：条纹图案指向带有右手原丝（θ > 0）的微管正端和指向带有左手原丝（θ < 0）的微管负端。

图6.微管图像过滤。A.选择Ĵ 0和第一峰的Ĵ Ñ 。B.过滤的图像。波纹图案显示的箭头形状指向图像的左侧。

初丝偏斜角的确定
选择“过滤图像”，然后单击“确定原丝角度”。选择“过滤后的图像” （图7A）并使用箭头键移动线，使其越过条纹图案的最小值和最大值（向上6个像素），然后按“确定”。
注意：如果微管的原丝数目均匀，则该线应适当放置在过滤图像的中间。在这里，原丝数是奇数（N = 15），因此必须将线稍微偏离中心移动，以越过莫尔条纹的最大值和最小值。

打开三个与线轮廓相对应的线图（“线强度”，图7B），用于减弱局部变化（如果存在）的平滑版本（未显示）以及平滑线轮廓的绝对值（“ abs（）之后的线强度） '图7C）。将打开一个窗口，提供测量的周期（以像素为单位，图7D），像素大小和原丝间隔（默认设置为48.95Å）。由于先前已确定它为正，因此取消选中“负pf角”，然后按“确定”。打开一个窗口以关闭中间窗口，然后按“确定”。
关闭过滤的图像。
在对数窗口中给出了莫尔条纹周期L （1906.56Å）和原丝偏斜角theta（+1.47Å）。

注意：原丝偏斜角θ根据以下公式计算：

其中x表示相邻原丝之间的间隔。原丝x之间的分离很难从单个图像中检索。如果样本中存在几种类型的微管，可以通过测量图像宽度随原丝数的变化来估计（Chrétien和Wade ，1991 ）。默认值48.95Å是从具有11至16个原丝的中分辨率微管3D图获得的（Sui和Downing，2010年）。

图7.确定原丝偏斜角。A.莫尔轮廓的选择。B.线形揭示了云纹期（两个最大值或最小值之间的距离）。C.云纹期的绝对值。已实施该策略以测量低原丝偏斜角，其中仅出现一半的莫尔纹重复（就像在大多数13_3微管中一样）。

堆栈生成
选择“ image_orig-straight_Centered ”，然后按“从直线MT创建堆栈”。将原丝编号固定为15，将螺旋起始编号固定为4（图8A）。设置其他参数，然后按“确定”。
笔记：

一种。提供了“从弯曲MT创建堆栈”例程，以从原始（经对比度校正）微管图像（在工作目录中另存为“ orig_corrected.tif ” ）中提取堆栈图像。如果希望使用其他3D重建软件处理图像堆栈，则此选项很有用。

b。严格确定N和S要求对图像的傅里叶变换（Stewart，1988）中的层线的位置和相位进行详细分析，这超出了该协议的范围。N的奇偶性可以通过条纹图案的对称性来确定：对于偶数的原丝数，其中心位于中心；对于奇数的原丝数，其中心位于中心。N的值可以通过比较微管直径与存在于样品中的其它微管来估计，并且还通过条纹图案具有不同N_S配置微管的发布的图像（Chréti比较EN和Fuller ，2000）。可以从原丝偏斜角的符号（表1）估算出螺旋起始数S。在当前情况下，N = 15并且θ为正，因此S = 4。

表1 。从纯化的微管蛋白体外组装的主要微管类型的θ符号（取自Chrétien和Fuller ，2000年），否：未观察到。后面这些N_S构型要求原丝偏斜角>±4°，这可能代表微管蛋白分子可以适应的扭曲极限。

ñ

10

11

12

13

14

15

16

S = 2

--

--

--

--

--

没有

没有

S = 3

+

+

+

+/-

--

--

--

S = 4

没有

没有

没有

+

+

+

+

将打开一个窗口，询问大约MT长度（86像素；图8B）。设置该值，然后按“确定”。在结果窗口中给出了分配给堆栈图像的增量“ Z平移”（1.26像素）和“角度平移”（-95.966°）。
笔记：

一种。“螺旋上升”（r = 9.64Å）对应于相邻原丝中微管蛋白单体之间的纵向错位。根据以下公式计算：

其中S表示单体螺旋起始编号，微管蛋白亚基沿着原丝重复，a为原丝数量N，原丝之间的间隔x，摩尔纹期为L（符号θ ）。

b。“大约MT长度”值确定了将在后续步骤中计算的体积高度，以使其包含至少4个单体螺旋起点。

甲histogr上午打开，显示分配给该堆栈（“角度分布”），图11的图像中的角度分布URE 8C。展示了一个堆栈（“ image_orig-straight_Centered_angle_-95.966”，图8D），该堆栈由2214张图像组成，这些图像对应于沿微管图像在每个子单元单体位置提取的视图。

图8.堆栈生成。A.堆栈生成参数。B.堆高。C.堆栈图像的角度分布。D.图像堆栈。

表2总结了此分析得出的微管晶格参数：

表2 。微管晶格参数。极性从原始图像的正端（左）到负端（右）。

ñ

小号

一个（Å）

r （Å）

 θ （° ） 

极性

15

4

40 .87

9.64

+1.47

+ /-

3D重建
单击“计算MT 3D重建”。让“反转强度？” 选中，并将“加权半径”设置为0.0（图9A），然后按“确定”。
笔记：

一种。在散焦条件下在相机上拍摄的图像显示蛋白质为深色。因此，为了在UCSF Chimera中检查这些数据，必须进行对比度反演（J）。记录在底片上的扫描图像将蛋白质密度显示为白色。在这种情况下，请取消选中“反转强度？” 按钮。

b。可以将加权半径设置为较高的值（0到0.5之间），以减弱低频的影响，低频的影响在反投影过程中会放大（Radermacher ，1992）。然而，这样做的代价是在最终的3D重建中增加了噪声。

将打开一个“ Progression…”窗口（图9B）：等待直到计算出“ stack_straight_3dReconstruction”（图9C）。滚动浏览该体积，在该体积中清晰可见微管蛋白亚基（以白色显示）。选择' Image- > Stacks- > Reslice [/]…'，然后选择'Start at：top'，然后按'OK'（图9D）。所述ASY微管蛋白亚单位的mmetry表明我们看这个地图从正端（克雷蒂安等人，1996;索萨和克雷蒂安，1998;另见（J））。3D贴图的从上到下方向与原始图像中的从左到右方向相对应，这表明极性分配正确。
选择“ stack_straight_3dReconstruction”，然后单击“伸长3D MT”（图9E）。将第三个参数作为默认值，将最终长度固定为1024，然后按“确定”。这产生了微管的细长形式，在其中可以观察到原丝偏斜和它的惯用性（图9F）。
注意：用于拉长微管的z偏移和角度偏移对应于基本的一个起始螺旋的参数，该基本起始螺旋连接微管晶格中的所有微管蛋白亚基。这些值还用于执行微管的3D重建，请参见Blestel等。（2009）以获得更详细的信息。



图9.微管3D重建。A. 3D重建参数。B.进度条。C. 3D重建。D.从顶部观察到的3D重建。E.伸长率参数。F.微管的延长版。原型丝的右手斜度清晰可见。

检查工作目录，已创建了几个文件（按时间顺序列出）：
一种。Calibration.cvs ：pixelSize ，以Å为单位的像素大小。

b。image_orig.tif ：从原始图像提取的区域。

C。image_corrected.tif ：从原始图像提取的区域已针对对比度变化进行了校正。

d。centres.txt：本地中心的数量及其x，y坐标。

e。Straight_image.tif ：拉直的图像。

F。image_orig-straight_Centered.tif ：以直线图像为中心。

G。analyticsFFT.csv：pixelSize ，以Å为单位的像素大小；monomerRepeat ，单体重复沿原丝（以A）; thetaSign ，theta的符号（1个正数，-1个负数）。

H。已过滤image.tif ：已过滤图像。

一世。protofilament.csv：l（像素），莫尔周期（以像素为单位）；pixelSize ，像素大小（以Å为单位）；L（埃），莫尔周期（埃），Pf分离（埃）；原丝分离（以Å为单位）；θ，原丝偏斜角（°）。

j。angle_distribution.csv：在堆栈中为每个角度（Y）分配的视图数，范围为0°至359°（X）。

k。angles.txt：分配给堆栈图像的角度方向。

l。elongation.csv：zshift ，微管蛋白单体相对于微管纵轴的Z轴上升；angleshift ，微管蛋白单体绕微管Z轴的角增量；nbProtofilaments ，原型线号；helicalRise ，微管蛋白亚单位沿相邻原丝的螺旋上升。

米 stack_straight.tif ：用于3D重建的图像堆栈。

。stack_straight_3dreconstruction.tif：微管的3D重建。

o。3dReconstruction_elongated.tif：3D重建的拉长版本。

UCSF Chimera对3D重建的观察
将保存在工作目录中的“ stack_straight_3dreconstruction.tif”卷打开到UCSF Chimera中。
显示命令行：“菜单->收藏夹->命令行”。
打开相机查看器：“菜单- >工具->查看控件->相机”，然后选择“正交”。
打开“体积”查看器：“菜单->工具->体积数据->体积查看器”，然后在“功能”菜单中，选中“亮度和透明度”，“坐标”以及“阈值和颜色”。
调整“等级”来放大微管蛋白的密度（例如，为“等级= 300”）和设置“透明度”至0.50。
在命令行中，输入'turn x 90 1' 。
将体素大小设置为2.16Å，然后按居中。
选择“查看窗口”的“侧视图”选项卡，然后按“查看全部”。
打开微管蛋白图1tub：“菜单->文件->按ID提取...”，选中“ PDB”按钮，输入1tub并按“提取”。
在命令行中输入' move 62，-30，-30 mod＃1; y 90 1 mod＃1中心＃1 '。从顶部观察微管蛋白图的正端（图10A）。将1tub模型的整体形状与微管图的整体形状进行比较，可以确认正端点指向重建的顶部。
在命令行中，输入“ move -45，-110,0 mod＃0”。选择'Volume Viewer-> Tools-> Fit in Map'，然后将'1tub（＃1）放入地图'stack_straight_3dreconstruction.tif（＃0）'中。检查微管（图的三维密度内的1tub模型的拟合小号10B- 10 F）。
注意事项：

一种。1tub模型的整体形状与3D重建之间的良好一致性包括结构图案的对应关系，例如与横向相互作用相对应的密度，H1-S2-环向内指向和C端α-螺旋向外指向（图10B）充分确定了从分析得出的参数已经确定。

b。原始图像尚未针对对比度传递函数的效果进行校正。这可以在处理TubuleJ中的图像之前执行，以提高最终重建的质量。

将会话保存在工作目录中为“ MTa.py”。
关闭会话并打开“ 3dReconstruction_elongated.tif”。
将步长设置为2，并将“水平”设置为300。在这种细长的微管3D重建版本中，可以清晰地看到原丝的右手倾斜（图10G）。
将会话另存为“ MTa_Elongated.py”。
注意：视频2中提供了使用UCSF Chimera的可视化过程。

图10.使用UCSF Chimera进行3D重建的可视化。A.将1D微管蛋白模型与3D重建进行比较。B.使1tub适合3D重建。加上端视图。指出了允许微管蛋白模型与3D重建良好匹配的结构特征。C.负端视图。D.内部视图。E.外观。F.侧视图。G. 3D重建的加长版。

视频2.使用UCSF Chimera进行3D重建的观察

致谢

这项工作得到了资助法新社国立德拉RECHERCHE（ANR-16 C11-0017-01）。我们感谢S. Blestel谁写的原始版本TubuleJ 。在Blestel等人中发表了TubuleJ中使用的微管中心的测定。（2009）。TubuleJ用于Estévez- Gallego等人。（2020）来分析GTP，GMPCPP和GDP-BEF的存在组装的微管结构3 - 。

利益争夺

TubuleJ已以代码IDID.FR.001.240023的形式存放到程序保护局（APP）。000.SP 2011.000.21000。

参考文献

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