材料和试剂

1.7 ml微型管（Corning Incorporated，Axygen ，目录号：MCT-175-C）
50 ml离心管（VWR，目录号：525-0637）
手套（VWR，货号：89038-270）
金抹布（Kimberly-Clark Professional，货号：34120）
移液器提示：
10 μ升XL渐变提示（美国科学，提示一，目录号：1110-3700）

200 μ升毕业连结架（实验室制品销售，目录号：130430）

1250 μ升吸头（实验室产品销售，目录号：L134770）

重组蛋白
SidJ 89-8 53截短，SdeA 211-1152截短，人钙调蛋白2在大肠杆菌中表达，带有N端6XHis-SUMO标签，并按照先前的描述进行纯化（Sulpizio et al。，2019）。Rab33b（1-200）也按照（Sulpizio et al。，2019）中所述的蛋白质进行纯化，Ub如Akturk et al。（2018）。将最终纯化的蛋白质储存在不含甘油的缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl）中，分装，速冻，并保存在-80 °C下。

β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐（NAD）（Sigma，目录号：N0632-1G）
一水合L-谷氨酸一钠盐（USB Corporation，目录号：16245）
2-巯基乙醇（Sigma，目录号：M3148-100ML）
30％丙烯酰胺/双酚37.5：1（Bio - Rad，目录号：1610158）
冰醋酸（JT Baker，目录号：9508-06）
腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物（Sigma，目录号：A2382-10G）
过硫酸铵（APS）（Amresco ，目录号：0486-100G）
艳蓝R-250（Fisher，货号：BP101-50）
溴酚蓝钠盐（Fisher，目录号：BP114-25）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Amresco ，目录号：M109-25g）
耐乙醇200（Koptec ，目录号：V1001）
甘油（Mallinckrodt Chemicals，目录号：5092-16）
甘氨酸（VWR，目录号：0167-5KG）
六水合氯化镁（Mallinckrodt Chemicals，目录号：5958-04）
甲醇（Fisher ，目录号：A454SK-4）
N，N ，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Bio - Rad，目录号：161-0800）
Precision Plus Protein All Blue Standards蛋白梯（Bio - Rad，目录号：161-0373）
氯化钠（VWR，目录号：0241-10KG）
十二烷基硫酸钠（SDS）（VWR Life Sciences，目录号：0227-1KG）
Tris（VWR，目录号：0497-5KG）
反应缓冲液（请参见配方）
MgCl 2 1 M溶液（请参阅配方）
ATP 100 mM pH 7.5溶液（请参阅食谱）
谷氨酸1 M溶液（请参阅食谱）
10x SDS-PAGE运行缓冲区（请参阅配方）
10x Native-PAGE运行缓冲区（请参阅食谱）
SDS样品缓冲液（请参阅配方）
本机样本缓冲区（请参阅食谱）
考马斯染色（见食谱）
考马斯脱色溶液（请参阅食谱）
12％SDS-PAGE分辨凝胶（请参阅食谱）
4％SDS-PAGE堆积凝胶（请参阅食谱）
8％天然PAGE解析凝胶（请参阅食谱）
3％天然PAGE堆积凝胶（请参阅食谱）
注意：除非另有列出，否则产品按制造商的建议进行存储。

设备

-80 °C冷冻室（低温，型号：PV85-21）
电脑
干澡（基准，米Odel等：BSH1001）
定速离心机（基准，型号：C1008-C）
钳子
凝胶电泳仪（Bio - Rad，型号：Mini-PROTEAN Tetra System）
凝胶电泳电源（Bio - Rad，型号：PowerPac Basic）
凝胶成像仪（Bio - Rad，型号：Chemidoc MP Imaging System）
冰桶
Labcoat （VWR，目录号：10141-306）
实验室胶带（VWR，目录号：89098-062）
微波炉（锋利，型号：R230KW）
移液器（Gilson ，型号：Pipetman classic P2，P20，P200，P1000，目录号：F144801，F123600，F123601，F123602）
摇床（Reliable Scientific，Inc.，型号：55D 12 x 16）
纸张保护贴（透明文件，Archival Plus 5x7打印，目录号：370100B）
涡旋混合器120V（Corning LSE，型号：6775）

程序

SidJ体外谷氨酰化反应
在开始该程序之前，请查看SidJ谷氨酰化和SdeA活性测定实验大纲的流程图（图1）。

图1. SidJ体外谷氨酰化和SdeA抑制测定的实验概述。此过程中描述的一般实验步骤的流程图。左分支用于测定Ub的SdeA ADP-核糖基化或磷酸-核糖基化的抑制。右分支是测定PR- Ub与底物连接的实验。

在冰上解冻重组纯化的SidJ 89-853，SdeA Core（截断211-1152），钙调蛋白，泛素和可选的Rab33b（1-200）。
注意：由于单个PR-泛素化条带的突出和蛋白质稳定性的提高，Rab33b 1-200被用于该测定（Jon Wasilko ，Mao Lab，未发表的结果）。也可以使用全长Rab33b。

将干浴预热至37 ° C。
通过在反应缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，50 mM NaCl）中稀释，在冰上制备表1中所列的储备溶液。新鲜制备NAD溶液，并使用储存在-80 ° C的谷氨酸和ATP储备液。

表1. SidJ体外谷氨酰化和SdeA抑制反应的原液浓度

零件

浓度

盛捷89-853

10 μ中号

钙调蛋白

100微米

SdeA核心

20微米

氯化镁2

125毫米

谷氨酸

125毫米

ATP pH 7.5

25毫米

泛素

625微米

Rab33b

250微米

NAD

25毫米

移液管的中列出原液的容积SidJ glutamylation反应行对于25 μ升表2中所列成冷冻1.7米反应升冰上微量离心管中。最后用移液器ATP引发反应。立即涡旋，短暂离心（约10 s最高速度），并在37 ° C的干浴中孵育样品30分钟。
注意：将样品彻底混合并离心很重要。SdeA非常活泼，反应混合物必须均匀才能获得最大抑制。

可选：为步骤A5准备预混料。通过移取储备溶液和每个反应10μl反应缓冲液，合并所有反应中包含的组分。准备比样品所需多约10％的反应混合物。向预混液中添加反应缓冲液会稀释成分，以保持蛋白质的稳定性。如果准备了主混合物，则对于每个反应，从表2中使用的量中减去混合物中包含的反应组分的体积和10μl反应缓冲液。

表2. SidJ体外谷氨酰化和SdeA修饰反应成分和浓度

反应类型

组件（库存）

反应浓度

蓄积量（μ升）

SidJ 89-853（10 μ中号）

0.5 μ中号

1.25

钙调蛋白（100 μ中号）

5微米

1.25

SidJ谷氨酰化

SdeA核心（20μM ）

1微米

1.25

反应（30分钟）

氯化镁2 （125毫米）

5毫米

1个

谷氨酸（125 m M）

5米中号

1个

ATP pH 7.5（25毫米）

1毫米

1个

泛素（625μM ）

25微米

1个

SdeA活动

Rab33b 1-200（250μM ）

10微米

1个

反应（30分钟）

NAD（25毫米）

1毫米

1个

反应缓冲液

到25 μ升

15.25

将测定法中SdeA活性部分的剩余反应成分移液到试管中。如果要测定ub Iquitin修饰，请用反应缓冲液替换Rab33b。立即涡旋，短暂离心（约10 s最大速度），并在37 ° C的干浴中孵育样品30分钟。
注意：一个主混合物含有SdeA修改组件和3 μ升每个样品反应缓冲液，可以制备以最小化移液误差。排除NAD的阴性对照将有助于可视化显示SdeA活性的缺失。

如果测定泛素修饰，通过吸取12.5各反应分成两个管μ升到另一个1.7米升微量离心管中。标签管和移液管3 μ升天然样品缓冲液为一个管，用于天然-PAGE分析，和3 μ升SDS样品缓冲液的成其他用于SDS-PAGE分析和蛋白质的可视化加载。涡旋混合并短暂离心（最大速度10 s）。如果仅测定PR-泛素连接活性，该反应可以通过加入6被停止μ升SDS样品缓冲液中。
注意：请勿在天然样品缓冲液，天然PAGE凝胶或天然PAGE运行缓冲液中包含SDS。

通过凝胶电泳检测泛素修饰和PR-泛素与Rab33b的连接
为了检测遍在蛋白修饰，electrophorese 13 μ升在80 V.天然样品中的每个样品的部分的缓冲器使用本机-PAGE凝胶和本机-PAGE电泳缓冲液一旦样品已通过积层凝胶迁移，增加电压至120伏电泳直至染料前沿在凝胶中迁移50-75％。
注意：需要Native-PAGE来检测泛素的修饰。使用冷的天然PAGE运行缓冲液，将凝胶仪器放置在冰上以及缩短的电泳距离可提供更好的蛋白质条带分离度和清晰度。

为了检测PR-泛素连接的和蛋白质负载的可视化的泛素修饰克EL，electrophorese 2.5 μ升蛋白梯和13的μ升缓冲液使用SDS-PAGE凝胶的SDS样品在每个反应中的（4％分离胶，12％溶解的凝胶）和80 V的SDS-PAGE运行缓冲液。一旦样品通过堆叠的凝胶迁移，将电压增加至150 V并电泳，直到染料前沿到达凝胶底部为止。
从流延玻璃中分离出凝胶，然后去除堆积的凝胶。将凝胶转移到带盖的微波安全塑料容器中。将考马斯染色剂倒入有盖容器中，短暂覆盖凝胶和微波，直到沸腾。通过与容器的最大距离，确保在移动容器时不要吸入烟雾。在室温下摇动数小时至过夜以对凝胶染色。
注意：使用考马斯染色在可视化钙调蛋白条带方面存在一些困难。如果钙调蛋白可以被充分染色，则可以降低染色温度和时间。

丢弃染色和漂洗用脱色溶液并孵育在d estaining溶液中约30分钟至1小时。丢弃溶液并重复孵育。重复直到可见蛋白带。如果仍然有一些背景污渍，请在步骤B5中进行更长的除水处理。
重新水化凝胶并通过在ddH 2 O中孵育1-2小时同时进一步脱色。除去水，并在必要时重复。添加金氏擦拭布可帮助脱色并提供更清洁的凝胶图像。
凝胶重新水化后，将凝胶转移到薄板保护器上，并使用凝胶成像仪成像。用金擦拭布擦拭灰尘和污点可帮助获得更清晰的图像（图2）。
分析结果。通过SdeA向泛素中添加磷酸核糖或ADP-核糖相对于泛素小蛋白的整体大小会引起明显的电荷变化。结果，这种改变极大地改变了天然凝胶上的电泳迁移率，而如果仅像SDS-PAGE那样仅通过蛋白质大小进行分离，则这种改变是不可见的。SdeA的抑制作用可防止泛素迁移（图2A）。该测定法不区分添加ADP-核糖和进一步修饰PR- Ub 。如果通过SdeA分析PR-泛素与Rab33b的连接，则在存在NAD的情况下，通过在未修饰的Rab33b带上方增加8 kDa的带移来检测连接。分子量带增加的出现对应于一个或多个PR- Ub与Rab33b的连接。与未抑制的SdeA反应相比，抑制SdeA的PR-泛素连接酶活性应降低修饰的Rab33b的强度（图2B）。

图2. SidJ介导的谷氨酰化和抑制SdeA所需的反应组分。A. Sid J抑制SdeA修饰泛素的能力。用表2中列出的反应组分和浓度进行SidJ谷氨酰化和SdeA修饰，用Rab33b 1-200替换反应缓冲液。如所示排除反应组分。SidJ体外glutamylation测定在37 30分钟进行° C，随后SdeA修改为在30分钟时37 ° Ç 。通过天然PAGE电泳蛋白质，并用考马斯亮蓝染色。B. SidJ抑制SdeA对PR-泛素Rab33b 1-200的能力。将反应物用表2中所列的浓度进行SidJ体外在37 glutamylation测定30分钟内进行° C，随后SdeA PR-泛素化30分钟，在37 °下的蛋白质通过SDS-PAGE的进行电泳d的凝胶用考马斯蓝染色。这个数字来自原始研究文章（Sulpizio et al。，2019）。

菜谱

反应缓冲液
50 mM Tris pH 7.5

50毫米氯化钠

室温保存

MgCl 2 1 M溶液
称取2.033克的米agnesium酰氯，6-水合物和d ilute到10 ml的用的DDH 2 ö

小号撕在室温下

ATP 100 mM pH 7.5溶液
称量551.14毫克一个denosine 5 '三磷酸二钠盐水合物和溶解8 ml的的的DDH 2 ö

甲djust pH至7.5 -10 M小号ODI微米氢氧化物和稀到10的终体积毫升用的DDH 2 ö

分装并储存在-80 ° C

谷氨酸1 M溶液
称取0.936 g L-谷氨酸一钠盐，蛋清水并用ddH 2 O稀释至5 ml

分装并储存在-80 ° C或准备新鲜

10x SDS-PAGE运行缓冲区
室温保存，用ddH 2 O稀释10倍使用

零件

1升

Tris-Base

30克

甘氨酸

140克

安全数据表

10克

ddH 2 O

至1升

10x Native-PAGE运行缓冲区
室温保存，用ddH 2 O稀释10倍使用

零件

1升

Tris-Base

35克

甘氨酸

144克

ddH 2 O

至1升

SDS样品缓冲液
在室温下储存，冷冻等分试样-20 ° C以延长储存时间

零件

浓度

溴酚蓝

0.25％（w / v）

DTT

50万

甘油

50％（v / v）

安全数据表

10％（w / v）

2-巯基乙醇

10％（v / v）

6x原生样本缓冲区
室温保存

零件

50百万升

ddH 2 O

3500万升

甘油

1500万升

溴酚蓝

0.125克

考马斯染色
室温保存

零件

500百万升

甲醇

225米升

ddH 2 O

225米升

冰醋酸

50百万升

艳蓝R250

1.25克

考马斯脱色溶液
室温保存

零件

1升

乙醇

450百万升

ddH 2 O

450百万升

冰醋酸

1亿升

SDS-PAGE凝胶

12％分解凝胶
零件

8凝胶

最终浓缩

ddH 2 O

13.3百万升

30％丙烯酰胺/双溶液

1600万升

12％

1.5 M Tris pH 8.8

10百万升

375毫米

10％SDS

400 μ升

0.1％

10％APS

300 μ升

0.075％

特美

24 μ升

0.06％

4％堆积凝胶
零件

8凝胶

最终浓缩

ddH 2 O

11.2百万升

30％丙烯酰胺/双溶液

2.16百万升

4.14％

1.0 M Tris pH 6.8

2升

128毫米

10％SDS

160 μ升

0.1％

10％APS

110 μ升

0.07％

特美

16 μ升

0.1％

天然PAGE凝胶

8％分解凝胶
零件

20米升（4个凝胶）

最终浓缩

ddH 2 O

9.34百万升

1.5 M Tris，pH 8.8

5百万升

375毫米

30％丙烯酰胺/双溶液

5.34百万升

8％

10％APS

100 μ升

0.05％

特美

20 μ升

0.1％

3％堆积凝胶
零件

10米升（4个凝胶）

最终浓缩

ddH 2 O

8.32百万升

1.0 M Tris，pH 6.8

500 μ升

50毫米

30％丙烯酰胺/双溶液

1.02百万升

3％

10％APS

50 μ升

0.05％

特美

10 μ升

0.1％

致谢

这项工作是由美国国立卫生研究院（NIH）资助5R01GM116964（至YM），支持康奈尔大学哈利和塞缪尔·曼优秀研究生奖（AGS），并通过在露丝L时NIH Kirschstein国家研究服务奖（6T32GM008267）从NIGMS（到MEM）。

来自原始研究文章的协议：Sulpizio，A.，ME Minelli，M. Wan，PD Burrowes，X.Wu，EJ Sanford，J.-H. Shin，BC威廉姆斯，ML Goldberg，MB Smolka和Y.Mao（2019）。“由细菌钙调蛋白依赖性假激酶SidJ催化的聚谷氨酰化作用。” eLife 8 ：e51162。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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