材料和试剂

消耗品

Filtropur BT 100瓶顶过滤器（容量：1000 ml；膜：PES；直径：90 mm；孔径：0.2 µm，用于无菌过滤）（Sarstedt ，目录号：83.3942.101）；用于过滤原液，仅一次性使用
Filtropur BT 25瓶顶过滤器（容量：250 ml；膜：PES；直径：90 mm；孔径：0.2 µm，用于无菌过滤）（Sarstedt ，目录号：83.3940.101）；用于过滤原液，仅一次性使用
Filtropur BT 50瓶顶过滤器（容量：500 ml；膜：PES；直径：90 mm；孔径：0.2 µm，用于无菌过滤）（Sarstedt ，目录号：83.3941.101）；用于过滤原液，仅一次性使用
玻璃试管，14 x 16 mm; 21毫升（DURAN ® ，目录号：26 130 21）
Gene-Pulse Cuvettes，0.2厘米间隙（Bio-Rad，目录号：1652086），仅限一次性使用
陪替氏培养皿，超深，一次性的，Lab- TEK TM （直径：100毫米;高度：26毫米;无菌）（供应商：Thermo Scientific的，VWR，目录号：NUNC4031）; 用于倒入再生培养基，仅一次性使用
培养皿深，带3个通风口（直径：92.3 mm ；高度：20 mm ；无菌）（供应商：Greiner Bio One，VWR，目录号：391-0493）；用于倒入再生前培养基，仅一次性使用
培养皿，带凸轮（直径：92 mm；高度：16 mm；无菌）（Sarstedt ，目录号：82.1473）；用于倒入YEP，共培养，静止和选择培养基，仅一次性使用
定性滤纸，标准级，1级，1 V，的Whatman ® （直径：85毫米）（VWR，目录号：516-0593）
1.5 ml反应管（Sarstedt ，目录号：72.690.001）
SafeSeal 反应管，2毫升（Sarstedt ，目录号：72.695.500）
手术刀刀片（使用BAYHA互锁系统的手术刀手柄类型11；非无菌）（Behr Labor-Technik，目录号：9409911）
50 ml螺帽管（Sarstedt ，目录号：62.547.254）
15 ml螺帽管（Sarstedt ，目录号：62.554.502）
血清移液管，10毫升（Sarstedt ，目录号：86.1254.001），仅限一次性使用
血清移液管，25 ml（Sarstedt ，目录号：86.1685.001），仅限一次性使用
血清移液管，5毫升（Sarstedt ，目录号：86.1253.001），仅限一次性使用
拉伸箔（Stretchplus ; 300.0 mx 40.0 cm;箔厚度：7 µm）
手术胶带（3M TM Micropore TM ;宽度：1.25 cm）
注射器（Injekt ® ;20毫升; 路厄锁）（布劳恩，目录号：4606205V），单次使用
注射器过滤单元Filtropur S 0.2（膜：PES；过滤表面：5.3 cm 2 ；孔径：0.2 µm，用于无菌过滤）（Sarstedt ，目录号：83.1826.001）；用于过滤植物激素和抗生素溶液，仅一次性使用
组织培养容器，Magenta TM GA-7（供应商：Sigma-Aldrich； 77 x 77 x 97 mm）（VWR，目录号：SAFSV8505）；用于倒入“ Roo”介质，可重复使用
木质牙签（6.8厘米）（Pap Star，目录号：12736）

生物材料

Komboka种子（IR05N221，L17WS.06＃24）
国际水稻研究所（菲律宾IRRI）根据特殊材料转让协议（SMTA-MLS）友情提供了Komboka种子。

将Komboka种子直接播入2升盆（高13.2厘米，直径16.7厘米）的圆形土壤中，每盆一株。异型多孔陶瓷（PPC）蔬菜等级和“拟南芥”比例为1：1的土壤混合物用作水稻种植的标准土壤。小号ee值表S1土壤组合物的详细信息。作为缓释肥料，Osmocote Exact 3-4 M 4克（16％N，3.9％P，10％K，1.2％Mg，0.45％Fe，0.06％Mn，0.02％B，0.05％Cu，0.02％在1 L的土壤中添加Mo，0.015％Zn）（ICL / SF UK）。另外，将植物从每周施肥2 Ñ d 周和每两周从6 个星期使用彼得斯的Excel（14％N，6％的P，14％发芽后K，6.5％的Ca，2.5％的Mg，0.12％的Fe， 0.06％Mn，0.02％B，0.015％Cu，0.01％Mo，0.015％Zn）（ICL / SF UK）。当植物达到开花期时终止施肥。将2升装满土壤的盆中的水稻植株浸入装满水的5升桶中，使内部的2升盆位于水线以下。水可以保留在桶中，直到水稻植株获得种子为止，无需交换。另外，也可以将2 L的饭锅放在60 x 40 x 6 cm的托盘中，并在水的上边缘装满水。在这种情况下，需要每两周更换一次水。

日光温度为30°C±2°C，夜间温度为25°C±2°C，水稻植物在具有自然日光和8/16日/夜光周期的附加光照的温室中生长，但并非严格要求。相对湿度在50-70％之间，可通过在温室地板上喷水来手动控制。将植物光合有效辐射（PAR）或光合光子通量密度下生长200微摩尔米的（PPFD）-2 小号-1 与PPFD蓝40微摩尔的米-2 小号-1 ，PPFD绿色的70微摩尔米- 2 s -1 和80 µmol m -2 s -1的PPFD-red 。

化学制品

注意：化学品批次和品牌是可能影响转化成功的重要因素。我们发现，首次尝试对Komboka进行转型时，对替代化学品牌的不明确使用通常会导致失败。因此，我们强烈建议使用此处指定的确切化学品（品牌和目录编号），尤其是在设置新的转化方案时。确保将化学品储存在规定的条件下，并且在到期后不要使用产品。对于化学品或仪器的选择，我们没有任何竞争利益。

1-萘乙酸，C 12 H 10 O 2 （Sigma-Aldrich ，目录号：N0640 ; CAS号：86-87-3），存放于室温
2 ，4-二氯苯氧乙酸，氯2 Ç 6 ħ 3 OCH 2 CO 2 H ^ （Sigma-Aldrich公司，目录号：D7299 ; CAS号：94-75-7），保存于室温
3' ，5'-D 甲氧基-4'-羟基苯乙酮，乙酰丁香酮，HOC 6 H 2 （OCH 3 ）2 COCH 3 （Sigma-Aldrich ，目录号：D134406 ; CAS号：2478-38-8），存放于4摄氏
6-苄基氨基嘌呤，C 12 H 11 N 5 （Sigma-Aldrich ，目录号：B3408 ; CAS号：1214-39-7），在室温下保存
I型琼脂糖，低EEO（Sigma-Aldrich ，目录号：A6013 ；CAS号：9012-36-6），在室温下存放
硝酸铵NH 4 NO 3 （西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich），目录号：A3795 ; CAS号：6484-52-2），存放在室温下
硫酸铵（NH 4 ）2 SO 4 （Sigma-Aldrich ，目录号：A3920 ; CAS号：7783-20-2），在室温下保存
细菌用琼脂，脱水（菲舍尔科学，目录号：214050），保存于室温
干燥的Bacto 牛肉提取物（Fischer Scientific ，目录号：211520），在RT存放
细菌用蛋白胨，脱水（菲舍尔科学，目录号：211677），保存于室温
细菌用酵母提取物（菲舍尔科学，目录号：212750），保存于室温
硼酸H3BO3（Sigma-Aldrich ，目录号：B6768 ; CAS号：10043-35-3），存放在RT
二水氯化钙CaCl 2 ·2H 2 O （Sigma-Aldrich ，目录号：C7902 ；CAS编号：10035-04-8），在室温下存放
羧苄青霉素二钠，C 17 H 16 N 2 Na 2 O 6 S （Duchefa ，目录号：C0109 ; CAS号：4800-94-6），在4°C下储存
头孢噻肟钠，C 16 H 16 N 5 O 7 S 2 Na（Duchefa ，目录号：C0111 ; CAS号：64485-93-4），储存在4°C
氯清洁器，例如，DanKlorix ® 原始（2.8克/ 百毫升次氯酸钠），保存于室温
六水合氯化钴（II），CoCl 2 ·6H 2 O （Sigma-Aldrich ，目录号：C2911 ；CAS号：7791-13-1），在室温下存放
五水合硫酸铜（II），CuSO 4 ·5H 2 O（Sigma-Aldrich ，目录号：C3036 ; CAS号：7758-99-8），存放于RT
D-（+）-葡萄糖，C 6 H 12 O 6 （Sigma-Aldrich ，目录号：G7021 ; CAS号：50-99-7），在室温下存放
D-甘露醇，C 6 H 14 O 6 （Sigma-Aldrich ，目录号：M1902 ; CAS号：69-65-8），在RT储存
D-山梨糖醇，C 6 H 14 O 6 （Carl Roth ，目录号：6213.1 ; CAS号：50-70-4），在室温下存放
的Difco TM 酪蛋白氨基酸，维生素分析（该RMO 费，目录号：228820），STOR È 在室温
二甲基亚砜（DMSO）（Fisher Scientific ，目录号：D / 4121 / PB15 ; CAS号：67-68-5），在RT存放
乙二胺四乙酸二钠二水合物，C 10 H 14 N 2 Na 2 O 8 ·2H 2 O（Sigma-Aldrich；目录号：E6635； CAS号：6381-92-6），在室温下存放
GELRITE TM （Duchefa ，目录号：G1101 ；CAS号：71010-52-1），在RT存放
甘油，SOLVAGREEN ® ≥ 98％，无水，欧洲药典。，C 3 ħ 8 ø 3 （卡尔罗斯，目录号：7530.1; CAS号：56-81-5），保存于室温
甘氨酸，NH 2 CH 2 COOH（Sigma-Aldrich，目录号：G8790 ; CAS号：56-40-6），存放在RT
潮霉素B溶液，CELLPURE ® 50毫克/毫升，无菌，C 2 0H 37 Ñ 3 ö 13 （卡尔罗斯，目录号：CP12.2 ; CAS编号：31282-04-9），保存于4℃下
氯化氢，HC 升，（Sigma-Aldrich公司，目录号：H1758-100ML ; CAS号：7647-01-0），保存于室温
七水合硫酸亚铁（FeSO 4 ·7H 2 O）（Sigma-Aldrich ，目录号：F8263 ；CAS 号：7782-63-0），在室温下存放
卡那霉素硫酸盐一水合物，C 18 H 36 N 4 O 11 · H 2 SO 4 · H 2 O（Duchefa ，目录号：K0126; CAS号：25389-94-0），储存在4°C
Kinetin，C 10 H 9 N 5 O（Sigma-Aldrich ，目录号：K3378 ; CAS号：525-79-1），在4°C下存储
L-精氨酸，H 2 NC（= NH）NH（CH 2 ）3 CH（NH 2 ）CO 2 H （Sigma-Aldrich ，目录号：A8094 ; CAS号：74-79-3），存放在RT
L-天冬氨酸，HO 2 CCH 2 CH（NH 2 ）CO 2 H （Sigma-Aldrich ，目录号：A7219 ; CAS号：56-84-8），存放在RT
L-谷氨酰胺，H 2 NCOCH 2 CH 2 CH（NH 2 ）CO 2 H （Sigma-Aldrich ，目录号：G8540 ; CAS号：56-85-9），在室温下保存
液氮
L-脯氨酸，C 5 H 9 NO 2 （Sigma-Aldrich ，目录号：P5607; CAS号：147-85-3），存放在RT
氯化镁，MgCl 2 （Sigma-Aldrich;目录号：M8266; CAS号：7786-30-3），存放在RT
七水合硫酸镁MgSO 4 ·7H 2 O（Sigma-Aldrich ，目录号：M2773； CAS号：10034-99-8），在室温下存放
一水合麦芽糖，C 12 H 22 O 11 ·H 2 O （Duchefa ，目录号：M0811； CAS号：6363-53-7），在室温下存放
一水合硫酸锰（II），MnSO 4 ·H 2 O （Sigma-Aldrich ，目录号：M7899; CAS号：10034-96-5），存放在RT
肌醇C 6 H 12 O 6 （Sigma-Aldrich ，目录号：I7508； CAS号：87-89-8），在室温下存放
烟酸C 6 H 5 NO 2 （Sigma-Aldrich ，目录号：N0761; CAS号：59-67-6），存放于室温
氯化钾，氯化钾（Sigma-Aldrich公司，目录号：P5405; CAS号：7447-40-7），保存于室温
氢氧化钾，KOH（Fisher Scientific ，目录号：10366240; CAS号：1310-58-3），存放在RT
碘化钾KI （Sigma-Aldrich ，目录号：P8166; CAS号：7681-11-0），存放在RT
硝酸钾，KNO 3 （西格玛奥德里奇，目录号：P8291; CAS号：7757-79-1），存放在室温
磷酸氢二钾，KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich ，目录号：P5655; CAS号：7778-77-0），存放在RT
盐酸吡rid 醇，C 8 H 11 NO 3 ·HCl （西格玛奥德里奇，目录号：P6280 ；化学文摘社编号：58-56-0），在室温保存
利福平，C 43 H 58 N 4 O 12 （Sigma-Aldrich，目录号：R3501; CAS号：13292-46-1），在4°C下储存
氯化钠NaCl（Sigma-Aldrich ，目录号：S7653; CAS号：7647-14-5），存放在RT
氢氧化钠，NaOH（Sigma-Aldrich ，目录号：30620-1KG-M; CAS号：1310-73-2），存放在RT
二水合钼酸钠Na 2 MoO 4 ·2H 2 O （Sigma-Aldrich ，目录号：331058； CAS编号：10102-40-6），在室温下保存
磷酸氢二钠NaH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich ，目录号：S5011 ; CAS号：7558-80-7），存放在RT
蔗糖，C 12 H 22 O 11 （Duchefa ，目录号：S0809 ； CAS号：57-50-1），在室温下存放
盐酸硫胺素，C 12 H 17 ClN 4 OS·HCl（西格玛奥德里奇，目录号：T1270 ；化学文摘社编号：67-03-8），在室温下保存
七水合硫酸锌ZnSO 4 ·7H 2 O（Sigma-Aldrich ，目录号：Z1001 ； CAS号：7446-20-0），在室温下存放
FASTAMP ® 工厂直接P CR试剂盒（Intactgenomics ，目录号：4612）
WTW TM TEP 4模型缓冲溶液pH 4（WTW TM ，目录号：108700）
WTW TM TEP 7模型缓冲溶液pH 7（WTW TM ，目录号：108702）
WTW TM TPL 10微量模型缓冲溶液pH 10.1 （WTW TM ，目录号：108805）
水稻土成分（见食谱）
储备液组成（请参见配方）
植物激素和抗生素（请参阅食谱）
栽培培养基成分（见食谱）
悬浮介质（请参见配方）
共培养培养基（请参见食谱）
静置介质（请参见食谱）
选择介质（请参见食谱）
再生前培养基（请参见食谱）
再生培养基（请参见食谱）
生根培养基（请参见食谱）
转换备忘单（请参阅食谱）
GUS染色液（请参阅配方）
X-Gluc解决方案（请参阅食谱）

设备

注意：设备可以适应不同的实验室条件，但是PETRI DISHES，MAGENTA BOXES是非常重要的工具，会影响转化效率。我们强烈建议使用与该协议相同的品牌。由于经常消毒，因此小刀和镊子必须是高质量的。确切的类型和品牌可能会根据个人选择进行调整。

-80°C 超低温冰箱（Panasonic，型号：MDF-U76V-PE）
分析和精密天平（PRECISA Gravimetrics AG ，系列321LS ，米奥德尔：LS 2200C和LS 120A）
高压釜（SYSTE Ç ，型号：3850 EL）
台式pH计 WTW TM inolab TM 7110（供应商：WTW TM 1AA114； Fis her Scientific ，目录号：11731381）
基本型生物光谱仪（Eppendorf ，目录号：6135000009）
5 L桶（Auer ，目录号：ER 5,6-226 + DK）
三角烧瓶中加入250ml （DURAN ® ，目录号：21 216 36）
生长室1  波斯富街，米Odel等：CU-41L5; 条件：30℃，持续光照的200微摩尔米（24/0白天/夜晚光周期）与光合光子通量密度（PPFD）-2 小号-1 与PPFD蓝色的40微摩尔米-2 小号-1 ，PPFD- 80 µmol m -2 s -1 的绿色和70 µmol m -2 s -1的PPFD-红色
生长室2  波斯富街，米Odel等：CU-41L5; 条件：27°C，16/8日/夜光周期，光子通量密度（PPFD）为200 µmol m -2 s -1 ，PPFD蓝色为30 µmol m -2 s -1 ，PPFD绿为70 µmol m -2 š -1 和PPFD-RED 60微摩尔米的-2 小号-1 
玻璃珠灭菌器（SkinMate Apus石英）
高精度镊子（110毫米; 5.SA型;超细尖端;不锈钢）（Behr Labor-Technik，目录号：6.266 876）
电穿孔仪（Bio-Rad Gene Pulser TM ）
孵化器/摇床28°C（Infors HT ，Multitron Standard）
接种环，PS 10UL PK / 25 （Hach ，目录号：2749125）
实验室瓶螺旋盖和浇注环，将100ml （杜兰® ，目录号：218012458）
实验室瓶螺旋盖和浇注环250毫升（杜兰® ，目录号：218013651）
实验室瓶螺旋盖和浇注环，将500ml （杜兰® ，目录号：218014459）
实验室瓶螺旋盖和浇注环，1 ，000个ml的（杜兰® ，目录号：218015455）
照度计（量子光谱仪，UPRtek ，PAR 300）
八角形电磁搅拌棒，带枢轴，蓝色，38 毫米（VWR ，目录号：442-0438）
移液器控制器Pipetboy acu 2（供应商：Integra（Biosciences）;适用于0.1至100 ml的玻璃和塑料移液器）（VWR ，目录号：613-4437）
聚碳酸酯真空干燥器（Sanplatec ，目录号：PC-250KG）
Pots SM-H Container 2.0 L（Meyer-shop ，货号：737203）
手术刀手柄（供应商：BAYHA GMBH;长度：160 mm ）（VWR，目录号：233-5202）
体视显微镜（Zeiss ，Discovery.v8，明场图像）
用于GFP成像的立体变焦和荧光科学显微镜（Zeiss ，AxioZoom.V16）
无菌工作台（热科技TM Heraguard TM ECO净化工作台）
温度计（Laserliner ThermoSpot ）
热循环仪（Bio-Rad ，型号：T100 TM ，目录号：1861096）
真空泵（Vacuubrand ，目录号：MZ 2C）
程序

准备库存解决方案
准备17种储备溶液，包括N6主剂1，N6主剂2，N6主剂3，N6主剂4，B5主剂1，B5主剂2，B5主剂3，B5主剂4，B5维生素，AA粗盐，AA微盐，甘氨酸， MS 1，MS 2，MS 3，MS 4和MS维生素与COMPO 小号银行足球比赛根据表S2。根据表S3准备植物激素和抗生素储备溶液。
过滤器将所有储备溶液灭菌，并保持在4 °C下。
无德小号：

务必对储备溶液进行过滤灭菌（过滤器孔径：0.2 µm，用于过滤器型号的耗材1、2、3、20 和21 ），请勿高压灭菌！
储备溶液可以在4 °C 下保存最多3个月。
请勿使用3个月以上的储备溶液。

准备培养基
按照表S4- 表S 11准备培养基。崇拜ivation介质组合物。
不Ë 小号：

正确调整pH值非常关键：在使用前务必校准pH计（对于pH 5.8，请使用pH 4和pH 7的校准溶液）。
始终非常精确地调节pH：对于需要pH 5.8的介质，可接受的pH值为5.80-5.81。
记录pH调节前后的pH 值。
始终在相同的介质温度下测量pH并在测量pH的同时记录介质温度（图3）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure03.jpg

图3. pH测量。A.在制备培养基时记录pH和温度。B.记录pH值时电极正确位置的细节。C.在显示屏上记录温度和pH值。

加入所有组分后测量pH，除了琼脂糖，植物激素和抗生素（小号EE 表S4- 表小号11 ˚F 或更多的细节），高压灭菌介质之前。
对于灭菌介质，必须使用短时间的高压灭菌循环：在121°C（101 kPa）下施加5分钟（！）的灭菌时间，并在灭菌器冷却至95°C后立即将介质转移至RT ，不要让介质在高压釜中停留更长的时间（图4）。灭菌时间取决于培养基的量，因为高压灭菌过程包括加热和冷却所需的额外时间。在此方案中，我们将培养基装在0.5 L的瓶子中，并在121°C（101 kPa）下施加5分钟的灭菌时间，整个高压灭菌周期为1.5 h。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure04.jpg

图4 。在121 °C （101 kPa）下高压灭菌5分钟（A）和20分钟（B）的培养基的比较。焦糖色素是一个很好的迹象的过度灭菌介质。高压灭菌后，介质颜色应几乎保持无色，如左图所示。

仅在培养基冷却至40-45°C（始终使用Laserliner 温度计检查温度！）后，高压灭菌后添加植物激素和抗生素。
将灭菌的工作台（生物安全柜）下板，请参阅表S4为类型P ETRI菜肴和量倾为每个平台。类型P ETRI菜迪菲租金不同的媒体和关键是要按照我们的建议。
仅在板完全干燥并且在P etri盘侧面看不到水凝结时才关闭盖（图5）。这是至关重要的，因为愈伤组织更喜欢在培养基上保持干燥，而湿的愈伤组织则不会再生。而且，不要过度干燥。过度干燥的介质会收缩并形成裂纹，由于含水量减少，溶质浓度会大大增加，从而影响敏感的愈伤组织和再生过程。
将板用拉伸箔包裹，并在室温下避光保存（图5）。不要冷藏媒体。
2周后用固体培养基弃去未使用的板。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure05.jpg

图5.培养基干燥和储存。A.完全干燥P ETRI菜。B.湿法P ETRI菜，冷凝水; 黑色箭头表示冷凝水。C.将板包装并在室温和黑暗中储存。

合格的农杆菌制备和转化
准备农杆菌（LBA4404或EHA105）感受态细胞。
条纹出农杆菌从10％甘油储备细胞与固体YEP培养基含有板（贮存在-80℃）20毫克/升利福平和incubat e计算在2天内的黑暗中28℃。
用无菌的牙签或移液器吸头挑选单个菌落，并在玻璃试管中用含有20 mg / L利福平的5 ml YEP液体培养基在黑暗中和28°C下过夜（12至16 h）培养，并于200°C摇动转速
在250 ml烧瓶中将1 ml过夜培养物加入35 ml液体YEP培养基和20 mg / L利福平中，在28°C下孵育黑暗，并以200 rpm摇动约8 h，直到OD 600 达到0.5-0.8。
在冰上冷却农杆菌5分钟。
离心机在50ml猎鹰细菌® 管以3,000 X 克，4℃ 下进行5分钟。
重悬沉淀在1ml 的20mM的CaCl 2 在50ml 猎鹰® 管（用于50毫升YEP，加入1ml的1M的CaCl 2 ）。
等分试样（50 微升）在一个2毫升安全锁微量离心管中，˚F 在-80℃下用液氮和存储间隙冻结。
用GUS / GFP报告基因构建物转化感受态农杆菌细胞（LBA4404或EHA105）。
从10％的甘油储备液（储存在-80°C）中取出等分试样（50μl）合格的根癌农杆菌LBA4404或EHA105，并在冰上融化10分钟。
在1.5 ml微量离心管中将细胞与1μl（〜100 ng）质粒DN A混合。
将混合物填充到无菌的冰冷电穿孔比色皿中（间隙为0.2 cm）。
使用电穿孔器以1.8 kV进行电穿孔。按直到“嗡嗡”的声音可以听到（约5 毫秒），保留所有其他设置为默认值：200 Ω，电容延长250 μFD ，电容25 μFD 。
脉冲后立即添加1 ml 不含抗生素的YEP 培养基，使用1 ml 移液器吸头上下吸液混合细胞。
将悬浮液转移到高压灭菌的1.5 ml微量离心管中，并在28°C下孵育30分钟，不要摇动。
以21 0 x g将细胞旋转1分钟。
小心除去上清液，但在1.5 ml微量离心管中保留约100μl培养基。
重悬在剩余的培养基中的细胞在1.5ml微量离心管中和PLA Ç Ë100微升上含有50mg / L卡那霉素和YEP琼脂平板20毫克/ L利福平。
在黑暗中于28°C孵育平板2天。
进行菌落PCR，通过检查选择标记基因的存在来选择转化菌落。在我们的情况下，确认的存在转移酶基因（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因编码的），我们使用下面的引物：Hpt_F ：5 ' -AGCCTGACCTATTGCATCT-3 ' ; Hpt_R ：5 ' -CATATGAAATCACGCCATGT-3 ' ，扩增子大小为200bp，T 米55℃。
选择1-3个阳性菌落，并在玻璃试管中接种含50 mg / L卡那霉素和20 mg / L利福平的3 ml液体YEP培养基。在28℃下生长的细菌中的d 柜以200rpm振摇过夜速度。
通过将0.6 ml培养物与0.3 ml 10％甘油（高压灭菌）在2 ml安全锁微量离心管中混合来制备Hpt 阳性农杆菌培养物的甘油储备，立即在液体N 2中冷冻并储存在-80°C。

注意：在这项研究中，我们使用了GUS rep ter构建体（pSWEET13：GUSplus）和GFP报告基因构建体（pOsUbi：eGFP ）（图6），它们由Joon- Seob Eom 博士（Heinrich Heine University，杜塞尔多夫，庆州）友情提供。韩国熙大学）和杨冰博士（美国密苏里大学）。从其他实验中，我们知道在pSWEET13和OsUbi 启动子下，GUS和GFP在愈伤组织和幼苗阶段均表达，因此我们使用这两种构建体检查转化效率。出于同一目的，可以使用任何其他GUS / GFP报告基因构建体。最佳的方法是使用GUS或GFP内含子构建体，因为土壤杆菌不会剪接内含子，因此不会引起假阳性愈伤组织或再生植物（Vancanneyt 等，1990）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure06.jpg

图6. 本研究中使用的两个带有GUS和GFP报告基因的质粒的图谱

ISO 未成熟胚的特征研
收获稻未成熟种子（8-12天后授粉）和地点300-400种子在50ml猎鹰® 管。在正确的发育阶段获得未成熟的种子非常重要。要检查未成熟胚的阶段，请轻轻挤压未成熟的种子并感觉其硬度。未成熟的种子应处于乳白色晚期，此时胚乳尚未完全细胞化，有关更多详细信息，请参见视频1。该收获步骤可以在无菌罩外进行，但以下所有步骤（包括脱壳，灭菌，未成熟胚的分离）均在无菌条件下进行。

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影片o 1 。未成熟种子的选择

在无菌条件下，洗涤种子用40毫升70％乙醇30秒与手在50ml猎鹰摇动® 管; d iscard乙醇。然后用40毫升无菌Milli-Q水清洗种子3次，弃去水。
将未成熟的种子穿入培养皿中，该培养皿上铺有湿润的无菌滤纸，并在立体显微镜下和在无菌条件下（在层流室中）用手术刀和镊子小心地除去种皮（内膜和内膜）（视频2，图） 7A-7B）。手术刀和镊子应通过使用例如玻璃珠灭菌器进行灭菌。需要冷却工具，以免热损伤未成熟的胚胎。

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参见ø2. d 未成熟种子的ehusking

放置未成熟在无菌条件下的种子在50毫升猎鹰® 管（一次稃和内稃已被去除）来启动灭菌工序（图7C）。
加40毫升乙醇中的70％，在无菌条件下，向猎鹰® 管，并用手30秒摇动。丢弃乙醇。用40 ml无菌Milli-Q水洗涤未成熟的种子。丢弃水。
在一个50ml无菌猎鹰® 管，准备5毫升商业漂白剂的混合物Klorix ® 用35毫升无菌Milli-Q水[ 终浓度的NaClO 为28克/升（0.376 M）] 。
该混合物添加到第È50毫升猎鹰® 含有未成熟的种子管，并用手5分钟摇动。
丢弃Klori X ® 混合物并用40ml无菌Milli-Q水冲洗种子，重复该过程15次，直到所有残留Klorix ® 被完全洗出。
注：这是非常重要的Klorix ® 完全淘汰，因为Klorix ® 会影响未成熟胚的萌发。我们建议在冲洗一个未成熟胚50毫升猎鹰® 管15倍用40毫升无菌Milli-Q水各添ë 。

地方未成熟种子到培养皿与使用立体显微镜下解剖刀和细镊子无菌滤纸，并仔细分离未成熟胚（IE）的（视频3，连接在无菌罩古尔7D）。请小心轻放，以免损坏或伤害未成熟的胚胎！

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录像3 。未成熟的胚胎分离

仅选择大小在1.3-1.8毫米之间的未受损未成熟胚。不成熟的胚胎应该是不透明的灰白色。透明的未成熟胚不会发芽。将约50个未成熟的胚胎（盾片朝上）放在共培养培养基上（图7E）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure07.jpg

图7 。农杆菌未成熟胚的分离和接种。A.在立体显微镜下去除内脏和外。B.脱壳未成熟的种子在P ETRI用湿的Whatman菜® PAP ER。比例尺：1 厘米。C.种子消毒用乙醇和Klorix ® 。D.在板上分离出的未成熟胚。E.盾片向上的未成熟胚（白色箭头），侧面未成熟的胚。比例尺：1 毫米。˚F 。农杆菌接种。

转型与共同培养
注意小号：

通常，我们建议使用100个未成熟胚进行一次转化。取决于转化效率，可以减少或增加作为原料的未成熟胚的数量。
我们建议使用未接种农杆菌的12个未成熟胚作为对照。在第一个选择步骤中，将6个未成熟对照胚移至没有潮霉素B的选择培养基中，以检查其再生能力。将其他6个对照未成熟胚移入含有30 mg / L潮霉素B的选择培养基中，以控制潮霉素B选择的有效性。这些是非常重要的控制措施，尤其是在尝试使此转化方案适应其他品种时。潮霉素B的浓度，再生培养基和接种时间可能必须适用于其他品种。
我们还建议记录所有数据，每个转化，例如日期，幼胚的数量以及任何注释（S EE 表S12为模板）。

在感染前两天，在含有抗生素（50 mg / L卡那霉素和20 mg / L利福平）的固态YEP平板上，从冷冻的-80°C储存中罢工土壤杆菌（LBA4404或EHA105）。然后在黑暗中于28°C孵育2天。
上转换的天，取3毫米大小的环的农杆菌培养物从YEP板和在悬浮介质中悬浮（表S5）我n中的50毫升猎鹰® 管。
涡旋细菌悬浮液并调节至OD 600 0.3。在黑暗中于25°C孵育1小时，无需摇动。
无德小号：

在使用前添加乙酰丁香酮并准备新鲜！
溶解乙酰丁香酮：50 ml的悬浮液培养，溶解10mg的乙酰丁香酮在100 微升DMSO中，然后取9.81微升溶液中，得到0.981毫克乙酰丁香酮; 无需过滤器灭菌。
始终非常精确地调整OD 600 ：根据光谱仪，推荐值在0.30和0.31 之间。
将5μl 农杆菌悬液滴在每个未成熟胚的顶部，盾片朝上（图7F）。
在土壤杆菌存在下，在黑暗中于25°C在黑暗中孵育带有胚胎的平板7天（图8）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure08.jpg

图8.共培养阶段结束时的未成熟胚。AC。控制无农杆菌感染的愈伤组织。DF。农杆菌感染的愈伤组织。

休息中
检查未成熟的胚胎是否可能受到污染（图9）。如果未成熟的胚胎受到污染，请将其丢弃。如果可能的话，可以拯救受污染平板中未受污染的未成熟胚，并将其放在单独的平板上。否则丢弃整个盘子。Ç 如果dehusking或未成熟胚隔离却没有这样做足够仔细和胚的过程期间用钳子或手术刀损坏，便于与其他微生物（图9）的污染可能发生ontamination。

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图9.未成熟胚胎的污染。A.对照显示未成熟胚（无农杆菌接种）显示细菌污染。B. 农杆菌接种的未成熟胚显示出被其他细菌污染。C.对照无感染的未成熟胚而无污染。D. 农杆菌接种的未成熟胚，无污染。

将未受污染的胚胎放置在无菌滤纸上，并用手术刀和镊子除去芽。执行此立体声下步骤- 显微镜E要保证完整切除芽。
一个。不应遗留任何枝条和边缘部分，将其全部除去（图10A和10 B）。

b。如果多余，请从愈伤组织中取出棕色组织，但要注意不要损坏未成熟的胚胎。

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图10.（A）之前和之后（B）去除芽的未成熟胚。箭头指示要去除的部分：芽（左下方），边缘（右下方）和棕色组织（上）。C.使用两层无菌滤纸清洁未成熟的胚胎。

通过将清洁的未成熟胚他们的无菌过滤器的两层之间的纸张（图10 C），并仔细DAB 关闭农杆菌。重复此过程至少两次，以去除多余的土壤杆菌。
转印未成熟胚盾片侧向上到停留mediu 米（16个未成熟胚/板）并孵育在生长室5天1  30℃，连续光照，24/0白天/夜晚光周期，光合光子通量密度（PPFD ）200 µmol m -2 s -1，其中PPFD蓝为40 µmol m -2 s -1 ，PPFD绿为80 µmol m -2 s -1 ，PPFD红为70 µmol m -2 s -1 ] （图11）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure11.jpg

图11.静止期结束时的未成熟胚胎。AC。控制未成熟的胚胎。DF。农杆菌接种的未成熟胚。

无德小号：

使用体视显微镜检查未成熟胚胎的状态（例如，是否有任何污染），清洁棕色组织并更轻柔地取出未成熟胚胎。
不要将未成熟的胚胎推入培养基中，让它们松散地停留在培养基顶部。
在培养基之间转移时（半盾板朝培养基上方），将未成熟的胚胎保持在相同的位置。
用两层Micropore 3M胶带密封板。

选拔
休息5天后，用镊子和手术刀彻底刮掉棕色组织，从未成熟胚胎的表面刮擦或切下棕色组织。将未成熟的胚胎转移到含有30 mg / L潮霉素B （16愈伤组织/ 平板）的选择培养基上。孵育在30℃下，在连续光照10天[ 200微摩尔米24/0白天/夜晚光周期，光合光子通量密度（PPFD）-2 小号-1 与PPFD蓝色的40微摩尔米-2 小号-1 ， PPFD绿色的80微摩尔米-2 小号-1 和PPFD-RED 70微摩尔米的-2 小号-1 ] （1 ST 选择）（图12）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure12.jpg

图12.在第一个选择阶段结束时的未成熟胚胎。A，D。控制没有潮霉素的未成熟胚B，未成熟胚产生致密的胚性愈伤组织并开始变绿。B，E。在含有30 mg / L潮霉素B的选择培养基上控制未成熟胚。未成熟胚不能完全变成褐色，也不能生长。C，F。农杆菌接种的未成熟胚可能部分或完全变成褐色。

后1 10天ST 的SelectIO n时，愈伤组织转移到与选择培养基新鲜制备的板（16 immat URE 胚/皿）。在30℃下，在连续光照10天除去棕色组织尽可能从未成熟胚，并培育可能[ 24/0白天/夜晚光周期，光量子通量密度200微摩尔的（PPFD）米-2 小号-1 与PPFD蓝40微摩尔的米-2 小号-1 ，PPFD绿色80微摩尔的米-2 小号-1 和PPFD-RED的70微摩尔米-2 小号-1 ] （2 次选择）（图13）。第一次选择后，一些未成熟的胚胎会完全变成褐色。在这种情况下，请勿去除棕色组织并保留整个未成熟的胚胎。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure13.jpg

图13. 第二选择阶段后的未成熟胚胎。A，D。对照没有潮霉素的未成熟胚B产生增殖的胚性愈伤组织。B，E。用30mg / L潮霉素控制未成熟胚。B，未成熟胚保持其大小（2-4mm），而不产生任何愈伤组织。C，F。在选择培养基上接种农杆菌的未成熟胚产生小的，致密的和浅黄色的胚性微愈伤组织（黑色箭头）。

后的210天第二选择，只需要在EMB ryogenic microcalli从黑色未成熟胚和地点到新鲜的选择培养基（16个未成熟胚/皿），温育在30℃下在连续LIG10天HT [ 24/0天/夜间光周期，光合通量密度（PPFD）为200 µmol m -2 s -1，其中PPFD蓝为40 µmol m -2 s -1 ，PPFD绿为80 µmol m -2 s -1 ，PPFD-红色的70微摩尔米-2 小号-1 ] （3 次选择）（图14）。胚性愈伤组织是小的，紧密的细胞簇，通常为浅黄色（图13 F）。非胚性愈伤组织通常是较大的，柔软的，半透明的和黄色或灰色的细胞松弛簇。如果新鲜分离的微愈伤组织不生长或需要更多的微愈伤组织，则可以将“未成熟的母亲胚”作为选择保存在选择培养基上。对于此步骤，通过将P etri盘分成小区域，分别保存来自不同未成熟胚的微愈伤组织（图14 C）。分离的微迹将被视为独立事件。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure14.jpg

图14. 第三选择阶段结束时的微调。A，D。不含潮霉素的对照愈伤组织B是致密的，胚胎发生的并且部分变为绿色。B，E。用30mg / L潮霉素控制未成熟胚。B，未成熟胚保持相同大小并且不生长。C，F。农杆菌接种的微愈伤组织在选择培养基上增殖。

不Ë 小号：

使用体视显微镜检查未成熟胚/愈伤组织的状态，去除棕色组织并更精确地选择胚性愈伤组织。
不要将未成熟的胚/愈伤组织推入培养基中，让它们松散地停留在培养基顶部。
用两层Micropore 3M胶带密封板。
如果第二次选择后未产生微愈伤组织，请刷新选择培养基并再培养10天。如果再经过2-3轮选择后仍未产生微愈伤组织，则丢弃未成熟的胚。

植物再生
将抗性愈伤组织转移至含有30 mg / L潮霉素B（6-9愈伤组织/板）的再生前培养基中，并在连续光照下于30°C孵育10天[ 24/0日/夜光周期，光合光子通量密度（PPFD））200 µmol m -2 s -1，其中PPFD蓝为40 µmol m -2 s -1 ，PPFD绿为80 µmol m -2 s -1 ，PPFD红为70 µmol m -2 s -1 ] （图15）。
D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure15.jpg

图15。再生前阶段结束时的愈伤组织。A，D。不含潮霉素的对照愈伤组织B大多是绿色的。B，E。用30mg / L潮霉素B控制未成熟胚；未成熟的胚胎保持其大小并且不生长。C，F。农杆菌接种的增殖的愈伤组织带有绿点。

选择带有绿色斑点的增殖愈伤组织，其覆盖大约2/3的愈伤组织（图15F），并转移到含有30 mg / L潮霉素B（6愈伤组织/板）的再生培养基中，用于芽发育，并在30°C下孵育14在连续光天[ 24/0白天/夜晚光周期，光合光子通量密度为200微摩尔米（PPFD）-2 小号-1 与PPFD蓝色的40微摩尔米-2 小号-1 ，PPFD绿色的80微摩尔米-2 š -1 和PPFD-RED 70微摩尔米的-2 小号-1 ] （图16）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure16.jpg

图16.再生阶段结束时的愈伤组织。A.从没有潮霉素BB的对照愈伤组织中再生的植物含有30 mg / L潮霉素B的对照未成熟胚，未成熟胚没有生长。C. 农杆菌接种的愈伤组织的再生植物是推定的转化体。

如果愈伤组织未产生任何芽或仅产生小芽，则每14天将愈伤组织转移至新鲜制备的再生培养基板（每板6个愈伤组织）中，并在30°C下连续光照[ 24/0日/夜，光合通量密度（PPFD）为200 µmol m -2 s -1，其中PPFD蓝为40 µmol m -2 s -1 ，PPFD绿为80 µmol m -2 s -1 ，PPFD红为70 µmol m -2 s -1 ] ，直到形成小植株（从具有至少两片叶子和小根系的愈伤组织再生的小水稻植株，图16-17）。
从每个愈伤组织中选择1-3株小植株，并转移到装有不含有潮霉素B的生根培养基的Magenta TM GA-7容器中。将它们在27°C下孵育7天[ 具有光子通量密度（PPFD）的16/8天/夜光周期200微摩尔的米-2 小号-1 与PPFD蓝30微摩尔的米-2 小号-1 ，PPFD绿色的70微摩尔米-2 小号-1 和PPFD-RED 60微摩尔米的-2 小号-1 ] 。在此阶段，从不同愈伤组织再生的幼苗被认为是独立的转化事件，因此，以一株以上的幼苗作为后备，以确保所有推定的事件在生根步骤中均能旺盛生长。
7天后，当小植株到达Magenta TM 盒子的顶部时，将另一个Magenta TM 盒子放在顶部，为植物生长腾出更多空间（图17A）。将' double'Magenta TM 盒子放在27° C [ 16/8日/夜的光周期中，光子通量密度（PPFD）为200 µmol m -2 s -1 ，而PPFD蓝色为30 µmol m -2 s -1 ，PPFD绿色的70微摩尔米-2 小号-1 和PPFD-RED 60微摩尔的米-2 小号-1 ] 另外7天。
转移约轻轻洗掉附着在根部的多余琼脂糖，将其浸入土壤1 5厘米高。在玻璃盆中种植小植株，然后将其种植在较大的水桶中，以保持玻璃屋中的高湿度条件，该玻璃屋具有自然日光和额外的8/16日/夜光周期的日光，白天温度为30°C±2°C，晚上温度为25°C±2°C。相对湿度在50-70％之间。植物在200微摩尔米的光合有效辐射（PAR）或光合光子通量密度（PPFD）下生长-2 小号-1 与PPFD蓝40微摩尔的米-2 小号-1 ，PPFD绿色的70微摩尔米- 2 s - 1 和80 µmol m -2 s -1的PPFD-red 。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure17.jpg

图17.生根和种植。A，B。两周龄的再生植物，然后转移到土壤中。C.种植后立即再生植物。D.种植后两周再生的植物。

不Ë 小号：

使用体视显微镜检查愈伤组织/小植株的状态，选择愈伤组织并更轻柔地分离小植株。
不要将愈伤组织推入培养基中，让它们松散地放在培养基上。
密封P ETRI菜肴或品红TM GA-7船只用微孔3M胶带的两个层。
由于小植株是在连续光照（24/0日/夜）下再生的，因此我们建议在长日照条件（16/8日/夜）下使小植株长出生根步骤，以使其适应即将到来的短期生长温室的白天条件（8/16天/夜的光照周期）。
筛选转化植物
注意：在此协议中，我们并未明确确定转换事件。我们使用平行再生但未受到土壤杆菌感染的植物作为对照。在这些对照植物中，我们没有观察到GUS染色或GFP荧光。此处计数的所有转化事件均来自独立的未成熟胚（每转化一个未成熟胚中一株植物）。

100个Komboka未成熟胚的GUS内含子报道构建使用两个迪菲与转化租金农杆菌菌株（EHA105和LBA4404）导致14 个31 从独立的未成熟胚，分别推定的转化体（表1）。测试所有再生的植物的GUS活性。再生植物的所有叶子均显示出GUS活性（图18A-18B），除了对照植物也经历了整个实验过程，但没有农杆菌感染（图1 8C）。我们的结果可能表明，与EHA105相比，LBA4404菌株在转化Komboka方面更有效，但是如果不对许多独立转化进行仔细的定量分析，就无法判断不同农杆菌菌株的相对效率。

表1. 使用不同农杆菌菌株的Komboka的表观转化效率

构建体/ 农杆菌菌株

＃未成熟的胚胎

＃推定的独立事件

＃GUS积极事件

GUS / LBA4404

100

31

31

GUS / EHA105

100

14

14

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure18.jpg

图18.转化的Komboka叶片的GUS组织化学。A，B.从两个独立的未成熟胚再生的两种植物的GUS染色叶。C.来自一株对照植物的GUS染色的叶子在没有农杆菌感染的情况下再生，没有可检测的GUS活性。

使用农杆菌属菌株LBA4404 用GFP 报告基因构建体转化Komboka 导致54个独立事件（表2）。所有这54株植物的根均为GFP阳性（图19A-19E）。在未感染的植物中未观察到GFP荧光（图19F）。从54个GFP阳性事件中，通过PCR 从48个植物中扩增了200bp GFP基因片段（图20）。完整的T-DNA插入，遗传和拷贝数仍有待验证。

表2 。GFP报告基因构建Komboka的Ap 亲本转化效率

构造/

农杆菌菌株

＃未成熟的胚胎

＃推定的独立事件

＃GFP阳性事件

＃PCR阳性事件

GFP / LBA4404

100

54

54

48

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure19.jpg

图19。转化的Komboka的GFP荧光。AE。五个独立转化子的根在蓝光下。F.从组织培养物再生的未感染植物的根（对照）。比例尺：2000m 。所有照片均以相同的设置拍摄和显示。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure20.jpg

图20.通过PCR确认转化植物中200bp GFP基因片段的代表性凝胶图片。WT：从组织培养中再生的未感染植物。

调整其他水稻品种的转化方案
为了使该方案适用于其他品种的转化，我们建议使用GUS或GFP内含子报告子构建体评估每个步骤后的效率（Vancanneyt 等，1990）。例如，在共培养后，使用五个愈伤组织进行GUS染色或GPF筛选，以测试共培养步骤是否成功或是否需要调整共培养时间。

我们也建议使用非感染的未成熟胚作为对照，以检查潮霉素B选择的有效性以及关于媒体再生能力不含潮霉素B（参见Ñ OTE 2，小号挠度E），因为潮霉素B的敏感性和再生能力品种之间可能有所不同。潮霉素B的浓度可在5至50 mg / L 之间调整。调整的标准包括：控制未成熟的胚不能在含有潮霉素B的培养基上生长或产生微愈伤组织（图s 13、14、15）。

另一个相关的参数是不成熟胚发育的阶段，不同品种之间可能有所不同。未成熟的种子应处于乳白后期（视频1 ），通常在授粉后约8-12天大小为1.3- 1.8 mm。可以比较农杆菌菌株（AGL 1，LBA4404，EHA105）。同样，选择的回合数和预生成步骤的回合数可在1-3之间调整，直到产生微愈伤组织或绿色斑点。

数据分析

GUS染色
收获3厘米叶子和在15ml地方猎鹰® 管。
加入5 ml染色溶液（表S13和S14）。
在室温下将样品抽真空10分钟。
关闭管，在黑暗中于37°C下温育。
除去染色溶液。
加入70％的乙醇进行脱色（去除叶绿素）并在65°C下孵育样品。孵育时间影响脱色，组织孵育的时间越长，蓝色染料与背景的对比度越高，通常2-3天即可。在此孵育时间内，将70％的乙醇交换1或2次
只要组织保留在乙醇中，就可以在室温下保存很长时间（至少几个月不丢失颜色）。建议将样品存放在黑暗的地方。

GFP成像
用Zeiss AxioZoom.V16体视显微镜在蓝光下观察到GFP转化的Komboka的根，滤光片激发波长：450-490 nm，滤光片发射波长：500-550 nm，激发波长：488 nm，发射波长：509 nm，曝光时间4.59 s，变焦：0.7，总光学倍率：7倍。所有照片均以相同的设置拍摄和显示：黑色：2000，伽玛：1.0，白色：22897。

GFP编码基因的PCR
以检查GFP基因在再生植物的存在，FASTAMP ® 植物直接PCR试剂盒（Intactgenomics ）被用于扩增GFP使用下列引物编码区域的200bp的片段：VL_GFP_F1 5 ' -GCAAGCTGACCCTGAAGTTC-3 ' ，VL_GFP_R1 5 ' -GTCTTGTAGTTGCCGTCGTC-3 ' 。PCR条件：最初的变性步骤是在95°C下进行5分钟，然后在95°C下进行35个循环，持续30 s，在55°C下进行30 s，在72°C下进行20 s，最后在72°C下延伸10分钟并将反应保持在10℃。

菜谱

注意：有关配方，请参见补充文件（表S1-S14）。

水稻土成分（表S1 ）
储备液组成（表S2 ）
植物激素和抗生素（表S3 ）
栽培培养基组成（表S4 ）
悬浮介质（表S5 ）
C- 培养培养基（表S6 ）
静止介质（表S7 ）
选择介质（表S8 ）
再生前培养基（表S9 ）
再生培养基（表S10 ）
生根培养基（表S11 ）
转换备忘单（表S12 ）
GUS染色液（表S13 ）
X-Gluc解决方案（表S14 ）

致谢

非常感谢Bill and Melinda Gates基金会，Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG，德国研究基金会）根据德国的卓越战略– EXC-2048 / 1 –项目ID 390686111，以及Alexander von Humboldt教授的资助提供了资金。感谢IRRI提供的Komboka种子，Bing Yang （美国密苏里大学）和Joon S. Eom （美国Heinrich Heine大学，杜塞尔多夫，韩国庆熙大学）提供了GFP和GUS的报告基因。感谢Marina Manzanilla在IRRI基因转化实验室的培训。感谢Monika Streubel 和Joon S. Eom 在植物转化中的宝贵建议。

利益争夺

德国杜塞尔多夫海因里希海涅大学（HHU）分子生理研究所，哥伦比亚卡利热带农业中心（CIAT）和菲律宾国际水稻研究所（IRRI）对协议的发展做出了同样的贡献。作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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